基于光譜研究生物功能化的納米材料.pdf

1、十幾年前，寡聚核苷酸被固定在金納米顆粒的表面。此后，這項(xiàng)技術(shù)獲得了廣泛的應(yīng)用，如：診斷和識(shí)別核酸和蛋白質(zhì)，控制納米材料的組裝，痕量檢測(cè)污染物。元論是修飾納米材料還是檢測(cè)生物分子，將DNA穩(wěn)定地連接在金納米顆粒的表面和精確控制修飾的DNA數(shù)量是關(guān)鍵的技術(shù)。很多的研究者設(shè)計(jì)了各種方案確定固定在金納米顆粒表面DNA的數(shù)目，分離不同數(shù)目DNA固定的金納米顆粒和研究不同方法修飾的金納米顆粒與不同途徑標(biāo)記的DNA親和性的差異。
　　 本文的

2、目標(biāo)主要集中在利用熒光光譜、拉曼光譜、紅外光譜、紫外可見吸收光譜等光譜手段對(duì)DNA在金納米顆粒和銀納米顆粒表面共價(jià)連接和非特異性吸附進(jìn)行定性觀測(cè)和定量分析。
　　 論文的第一部分工作主要是：實(shí)現(xiàn)DNA在金納米顆粒的表面快速和穩(wěn)定的共價(jià)連接，并精確測(cè)量和控制固定在金納米顆粒表面的DNA的數(shù)目。采用方法如下：構(gòu)建Au-DNA-FAM的共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)，其中FAM(熒光染料的一種，熒光發(fā)射峰在517nm)為能量的供體，粒徑為13nm金納

3、米顆粒(吸收峰在520nm)，巰基修飾的含有22個(gè)堿基對(duì)的DNA序列為連接部分，DNA標(biāo)記有巰基的一端和金納米顆粒形成Au-S共價(jià)鍵，DNA的另一端連接FAM?？梢酝ㄟ^熒光染料分子FAM的熒光值變化來表征DNA在金納米顆粒表面為共價(jià)連接還是物理吸附，并通過DNA上標(biāo)記的熒光染料分子FAM對(duì)未連接和共價(jià)連接的DNA數(shù)量進(jìn)行標(biāo)定。
　　 用Zony1-FSN包覆金納米顆粒和TCEP預(yù)處理巰基修飾的DNA是我們?cè)囼?yàn)中關(guān)鍵的兩步。Zon

4、y1-FSN保護(hù)的金納米顆?？梢缘钟?M濃度的氯化鈉;而高濃度的鹽可以增加巰基修飾的DNA固定在金納米顆粒表面的速率。這樣一輪實(shí)驗(yàn)所需要的時(shí)間可以從通常的兩天降到數(shù)個(gè)小時(shí)。TCEP能夠還原巰基之間形成的二硫鍵，能夠提高加入的DNA的連接效率從而減少實(shí)驗(yàn)的不確定因素。
　　 我們觀察到的現(xiàn)象有：
　　 (1)溶液中加入SH-DNA-FAM后，F(xiàn)AM的熒光值在最初的十分鐘有較快的下降，在接下來的一個(gè)小時(shí)內(nèi)緩慢下降，兩個(gè)小時(shí)候

5、熒光值趨于穩(wěn)定。溶液中加入DTT后，F(xiàn)AM的熒光值迅速恢復(fù)。
　　 (2)從HPLC色譜圖上可以看出，2.71min保留時(shí)間處對(duì)應(yīng)的為形成二硫鍵的DNA，TCEP處理后的量值為處理前的1/4，3.14min保留時(shí)間處對(duì)應(yīng)的為未形成二硫鍵的DNA，其量值處理后是處理前的五倍。
　　 (3)在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，金納米顆粒對(duì)于物理吸附在其表面的DNA-FAM熒光呈增強(qiáng)作用，約為兩倍。對(duì)于共價(jià)連接的SH-DNA-FAM呈現(xiàn)熒光淬

6、滅的作用，一旦用DTT將DNA從金納米顆粒表面取代，F(xiàn)AM的熒光即可恢復(fù)。
　　 (4)在DNA的濃度為1/3-2微摩爾之間，連接在金納米顆粒表面的數(shù)量和添加的DNA濃度呈線性關(guān)系。
　　 試驗(yàn)研究結(jié)果：
　　 (1)經(jīng)過Zony1-FsN包裹的金納米顆粒和SH-DNA-FAM之間的連接反應(yīng)在兩個(gè)小時(shí)之內(nèi)就結(jié)束，比傳統(tǒng)的方法（Mirkin連接方法）需要的時(shí)間（兩天）大大縮短。
　　 (2)在金納米顆粒上修

7、飾DNA的數(shù)目從平均數(shù)目為30-160根每個(gè)金納米顆?？烧{(diào)。關(guān)鍵的原因是經(jīng)過TCEP處理后的DNA，其末端修飾的巰基大部分都被活化，即體系中加入的DNA量和實(shí)際參加反應(yīng)的DNA量相差很小。
　　 (3)金納米顆粒表現(xiàn)出對(duì)FAM存在熒光增強(qiáng)和熒光淬滅兩種效應(yīng)。
　　 同樣，應(yīng)用光譜的方法，我們還表征了氨基修飾的DNA和表面修飾羧基的PS聚苯乙烯磁性微球的通過縮合反應(yīng)形成酰胺鍵的共價(jià)連接。這里，主要應(yīng)用紫外可見吸收光譜和紅外

8、光譜。在紫外可見吸收光譜中，溶液在260nm處的吸收值下降，說明游離的DNA數(shù)量減少；在紅外光譜中，連接了DNA的樣品在1080cm1和1231cm-1處出現(xiàn)新的歸屬于DNA和RNA磷酸根和磷脂的振動(dòng)峰，證明DNA共價(jià)連接在PS聚苯乙烯磁性微球的表面。
　　 論文的第二部分工作主要是：制備了銀納米顆粒并進(jìn)行表面修飾，研究其對(duì)不同序列DNA的表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)效應(yīng)。銀納米顆粒和金納米顆粒具有相似的光學(xué)特性：在可見光區(qū)域有

9、強(qiáng)烈的吸收，SPR(Surface PlasmonResonance)峰位置在420nm左右(金納米顆粒的SPR峰在：520-580nm);在相同粒徑的條件下，銀納米顆粒消光系數(shù)是金納米顆粒的四倍，同樣也有溶液的顏色隨粒徑之間距離變化的特點(diǎn)。但銀納米顆粒在SPR比色傳感中使用較少，主要的原因是銀納米顆粒表面容易被氧化，還原法制備的銀納米顆粒表面的官能團(tuán)不易被取代，銀納米顆粒在DNA連接和雜交的條件下不穩(wěn)定。
　　 我們利用銀納米