海洋微擬球藻microRNA測序鑒定及其轉(zhuǎn)基因體系的建立.pdf

1、microRNA(miRNA)是細胞內(nèi)源性的、由莖環(huán)結(jié)構(gòu)經(jīng)剪切產(chǎn)生的、長度在～22nt的單鏈RNA,它通過與靶標mRNA堿基互補配對降解靶標mRNA或抑制翻譯過程,參與基因的表達調(diào)控。它廣泛存在于人、動物、植物和病毒中,與人類疾病、動物生長發(fā)育、植物抗逆等過程密切相關(guān)。miRNA的研究目前在動植物中較為深入,在單細胞微藻中研究相對較少,僅在萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)和三角褐指藻(Phaeodactylu

2、m tricornutum)中有見報道。微擬球藻(Nannoehloropsis oceanica)屬于真眼點藻綱(Eustigmatophyceae),微擬球藻屬(Nannochloropsis),該藻富含EPA,有望成為EPA生產(chǎn)的原料。此外,該藻油脂含量達到干重的30％以上,可作為能源微藻良好的候選藻種。
　　本研究以海洋微擬球藻(Nannochloropsis oceanica)為實驗材料,通過Solexa高通量測序首次鑒

3、定了該藻中的miRNA,并建立了該藻的遺傳轉(zhuǎn)化體系,旨在海洋微擬球藻中實現(xiàn)利用人工設計的miRNA進行基因沉默奠定基礎。本研究包括如下二個部分:
　　第一部分,提取海洋微擬球藻的總RNA,分離其中小于200bp的小RNA,通過在小RNA的兩端加上人工接頭,構(gòu)建了小RNA的cDNA文庫,應用Solexa高通量測序,獲得了數(shù)百萬條小RNA序列,剔除tRNA、rRNA和可能的mRNA碎片,共獲得近2000條疑似miRNA序列,其中76％

4、的序列長度集中在20-22nt。將測得的序列分別與已經(jīng)報道的和海洋微擬球藻基因組進行比對,發(fā)現(xiàn)有37條序列與已經(jīng)報道的其他物種的miRNA相似性較高,相似度均達90％以上;2條序列與已知同源性較低,但是與已知的兩條miRNA的前體序列幾乎匹配,且與該藻基因組能夠完全匹配,而這2條序列在基因組的上下游序列可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),因此推測這2條序列可能為新的miRNA;1074條序列與已知的miRNA或miRNA的前體序列相似度很低,但與基因組的相

5、應序列可完全匹配,推測這組序列可能是海洋微擬球藻中特異性表達的miRNA。進一步分析表明,測序獲得的miRNA的5’端具有對U堿基的偏好性,這一現(xiàn)象與已經(jīng)報道的其他物種的miRNA相似。
　　遺傳轉(zhuǎn)化體系建立是利用人工設計的miRNA進行基因沉默的平臺和基礎。本研究第二部分構(gòu)建了海洋微擬球藻的轉(zhuǎn)基因體系。以pMS188和pCB801為基礎質(zhì)粒,成功構(gòu)建了同時含有抗性基因ble和多克隆位點的新載體pCJ901,進一步在多克隆位點中插