中華按蚊防御素基因的克隆、鑒定及轉(zhuǎn)基因體系的初步建立.pdf

1、研究背景：蚊媒可傳播許多人類疾病，WHO公布的“十大重點防治的疾病”中，瘧疾和絲蟲病均位于其中，瘧疾更是世界上感染率最高、死亡人數(shù)最多的疾病之一，每年約有超過30億人受瘧疾威脅，死亡人數(shù)達200余萬，2004年全國報告瘧疾發(fā)病38972例，發(fā)病率為0.38/萬。其他蚊媒病如登革熱日趨嚴重；美國西部西尼羅河腦炎病毒也在迅速蔓延。造成這些悲慘局面最主要的原因是缺乏有效預防瘧疾和其他蚊媒病的措施，以及蚊媒及病原不斷產(chǎn)生抗藥性。因此，探索并開發(fā)

2、新的防治蚊媒病措施已成為當前迫切需要解決的問題，而瘧原蟲耐藥性的出現(xiàn)意味著控制昆蟲媒介再一次成為最有效且實用的減輕瘧疾負擔的方法。 幾個世紀以來，昆蟲、瘧原蟲和哺乳動物宿主間的關系已達到了一種協(xié)調(diào)的狀態(tài)，使得瘧原蟲能夠在一定程度逃避人類和昆蟲免疫系統(tǒng)的殺傷而幸存。昆蟲是世界上最大的生物種群，據(jù)估計其種類多于1×106，個體數(shù)量超過1×1018，占整個動物數(shù)量的80％。除海洋外，其余的生態(tài)環(huán)境均有昆蟲分布，這表明昆蟲有極強的適應和

3、防御能力。但研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲并不具備高等動物高度專一的免疫體系，即昆蟲缺乏B和T淋巴細胞系統(tǒng)，也無免疫球蛋白及補體。但昆蟲能在自然界占據(jù)如此優(yōu)勢，表明其先天性或獲得性免疫能力非常驚人，其防御系統(tǒng)也必有獨到之處。 大量研究表明，在感染病菌或可能導致病菌感染(注射細菌或真菌，體壁損傷等)的情況下，昆蟲能快速合成大量抗菌肽，迅速殺滅已侵入的病菌，并阻止病菌繼續(xù)侵染。目前為止，在昆蟲中己發(fā)現(xiàn)大量的抗細菌肽、抗真菌肽以及既抗真菌又抗細菌的抗

4、菌肽。這些抗菌肽不僅對細菌、真菌有廣譜抗菌能力，對病毒、原蟲及癌細胞也有作用。很多可誘導的抗菌肽類蛋白質(zhì)，根據(jù)其各自特點，可分為四個主要大類：(1)形成兩性分子α-螺旋的抗細菌肽類，如天蠶素等；(2)有分子內(nèi)二硫橋的抗細菌肽類，如防御素或sapecins等；(3)富含脯氨酸的抗細菌肽類及富含甘氨酸的抗細菌多肽類，如攻擊素樣蛋白Attacins、SarcotoxinsⅡ、Diptericins等；(4)富含脯氨酸的蛋白，如Apidaeci

5、ns和abaecin。天蠶素能夠溶解并殺死多種革蘭氏陽性菌和陰性菌。攻擊素樣蛋白可阻斷大腸桿菌主要外膜的合成。而富含脯氨酸蛋白的抗菌機制，如apidaecines和abaecins尚不清楚。防御素(Defensins)是一類具有廣譜抗微生物與細胞毒活性的可誘導陽離子抗菌肽，為昆蟲體內(nèi)產(chǎn)生的最廣泛的抗微生物蛋白；在受到外來病原侵襲時，蚊蟲激活其內(nèi)源的防御素基因并在其脂肪體(相當于哺乳動物的肝臟)中大量表達，從而形成有效的防御系統(tǒng)。蚊蟲防御

6、素基因首先從埃及伊蚊(Aedesaegypti)中克隆出來；2000年，EgglestonP等報道了岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)防御素基因的DNA結構及其免疫調(diào)節(jié)作用。2002年，支國舟等在中國首先克隆了埃及伊蚊和白紋伊蚊(Aedesalbopictus)的防御素基因并進行序列分析。2002和2003年，劉先凱等進一步對埃及伊蚊和白紋伊蚊的defensinA基因進行了研究。而中華按蚊作為我國瘧疾的重要傳播媒介，其防御素

7、基因的全長cDNA序列和基因組序列及相關的序列鑒定和生物信息學分析目前國內(nèi)外均未見報道。 昆蟲媒介的基因調(diào)控為蚊媒病提供了一種新的防治方法，此方法主要通過調(diào)控昆蟲的染色體組，最終產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因昆蟲。本研究嘗試將中華按蚊的防御素全長cDNA序列及基因組DNA序列進行體外克隆，并將其編碼序列連接入帶有眼特異性啟動子(3xP3)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)、蚊卵黃蛋白原(vitellogenin，Vg)啟動子以及SV40polyA尾的

8、具有完整調(diào)控元件的重組載體質(zhì)粒后，用顯微注射的方法將其注入新鮮蚊卵中制備轉(zhuǎn)基因蚊，使其血餐后在Vg特異性啟動子的驅(qū)動下令防御素基因得到高效表達，從而使侵入蚊蟲體內(nèi)的病原不能繼續(xù)存活，則有望對蚊媒病的傳播起到一定阻斷作用。 目的：克隆中華按蚊防御素基因全長cDNA序列及基因組序列，并對其進行鑒定和生物信息學分析；構建出由眼特異性啟動子(3xP3)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標志物、Vg啟動子驅(qū)動的中華按蚊防御素全長cD

9、NA序列、SV40polyA尾以及具有高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的具有完整調(diào)控元件的重組載體質(zhì)粒pBac-Vg-Defensins-SV40；運用顯微注射技術進行轉(zhuǎn)基因蚊的制備并對孵化出的幼蟲進行了初步的定性分析。 方法： 1.采用分子生物學技術方法及美國ClontechLaboratories公司的基因組文庫構建試劑盒構建中華按蚊基因組文庫。 2.用巢式PCR(Nested-PCR)方法，以中華按蚊

10、基因組文庫為模板，克隆中華按蚊全長基因組DNA序列。 3.根據(jù)設計的多對引物，以中華按蚊總RNA為模板，用RT-PCR，克隆中華按蚊防御素基因全長cDNA序列。 4.用GenBank和ExPasy網(wǎng)站等提供的軟件，對克隆出的中華按蚊防御素全長基因組DNA序列及全長cDNA序列進行深入的生物信息學分析。 5.運用分子克隆技術，通過設計酶切位點，酶切，載體與目的基因的連接等方法，以美國加州大學河邊分校蟲媒病研究中心A

11、lexanderS.Raikhel教授饋贈的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBac[3xP3-DsRedafm]、pSLfa1180fa、pVg-SV40及輔助載體質(zhì)粒phsp-pBac為基礎質(zhì)粒，構建由眼特異性啟動子(3xP3)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標志物、Vg啟動子驅(qū)動的中華按蚊防御素全長cDNA序列、SV40polyA尾以及具有高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的具有完整調(diào)控元件的重組載體質(zhì)粒pBac-Vg-Defensins

12、-SV40。 6.運用顯微注射技術注射新鮮的蚊卵進行轉(zhuǎn)基因蚊的制備。 7.將注射完的蚊卵在27℃、濕度85％的條件下放置16-20h后轉(zhuǎn)移至39℃孵箱中，熱休克60min，然后轉(zhuǎn)移至27℃、濕度85％的環(huán)境中待孵化。在蚊卵孵化后進行轉(zhuǎn)基因蚊初步定性分析。 結果： 1.成功構建中華按蚊基因組文庫。 2.克隆了中華按蚊全長基因組DNA序列。 3.克隆了中華按蚊防御素基因全長cDNA序列。

13、 4.生物信息學分析結果顯示：中華按蚊全長cDNA序列為324bp，其開放閱讀框共編碼107個氨基酸，其中1-28位氨基酸殘基為信號肽部位，29-68位氨基酸殘基為前導肽部位，成熟肽部分位于68-107位氨基酸殘基，其中α-螺旋占36.45％，無規(guī)卷曲占29.91％，β-轉(zhuǎn)角占12.15％；為分泌性蛋白，跨膜方式為由胞里到胞外，具有一個跨膜超螺旋；理論分子量為11.1898kD，理論等電點pI為6.05，酸性氨基酸殘基總數(shù)為9，堿性氨

14、基酸殘基總數(shù)為10，脂質(zhì)參數(shù)88.32，親水性(GRAVY)0.160。將其全長編碼氨基酸序列與其他節(jié)肢動物比對發(fā)現(xiàn)：中華按蚊防御素基因編碼的蛋白質(zhì)與節(jié)肢動物編碼保守區(qū)域一致，與黑花蠅屬同一性達到76.19％，成熟肽部位相對保守，都具有6個半胱氨酸的保守區(qū)域，二硫鍵結合方式為C1-C4，C2-C5，C3-C6，序列變異主要發(fā)生在信號肽和前導肽部位。另外，通過中華按蚊全長基因組序列測定及分析鑒定得出：該序列長為2256bp，具有兩個外顯子

15、，由大小為85bp的內(nèi)含子所分隔；序列上游區(qū)域包括核心啟動子元件，如TATAbox、節(jié)肢動物通用起始序列TCAGT，以及一些上游免疫反應元件，如核因子NF-κB和GATA因子、核因子白介素6(NF-IL6)、干擾素一致反應元件(ICRE)、白細胞內(nèi)皮黏附分子5(HNF-5)和SP1，此外，其3'端還具有聚腺苷酸(polyA)尾轉(zhuǎn)錄的終止信號核苷酸序列。 5.構建出由眼特異性啟動子(3xP3)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩

16、選標志物、Vg啟動子驅(qū)動的中華按蚊防御素全長cDNA序列、SV40polyA尾以及具有高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的具有完整調(diào)控元件的重組載體質(zhì)粒pBac-Vg-Defensins-SV40。其中Vg啟動子為卵黃蛋白原編碼基因的啟動子序列，從理論上而言，在蚊血餐后可以用來驅(qū)動防御素基因通過吸血鏈激活并得到高效表達。 6.在熒光顯微鏡下觀察到孵化的轉(zhuǎn)基因蚊幼蟲眼部有3xP3啟動子驅(qū)動的DsRed表達出的眼特異性紅色熒光。

17、 結論：克隆出中華按蚊防御素全長基因組DNA序列和中華按蚊防御素基因全長cDNA序列，cDNA序列被GenBank收錄(登陸號：DQ002892)，并對其進行了深入的生物信息學分析。用由眼特異性啟動子(3xP3)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標志物、Vg啟動子驅(qū)動的中華按蚊防御素全長cDNA序列、SV40polyA尾以及具有高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的pBac-Vg-Defensins-SV40以及phsp