雷公藤內(nèi)生真菌的分離及其產(chǎn)甲素研究.pdf

1、雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.)屬衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，是一種珍貴的傳統(tǒng)藥用植物，在我國已有700多年的利用歷史，藥理作用廣泛，主要分布于我國的福建、浙江、安徽、江西、臺(tái)灣等省份。植物內(nèi)生真菌普遍存在于各種健康植物的組織或器官中，在與宿主植物的長期生活中互相影響形成互利共生體。在植物微生態(tài)系統(tǒng)中，內(nèi)生真菌長期生活在植物體內(nèi)，對(duì)宿主植物的生理生長產(chǎn)生重要影響，相關(guān)研究表明，植物內(nèi)生真菌具有益生長、增強(qiáng)宿

2、主植物抗逆性、增強(qiáng)宿主植物代謝等多種生物學(xué)作用，有的內(nèi)生真菌還能夠合成與宿主植物相同或相近的次生代謝產(chǎn)物。目前，雷公藤的來源主要以采挖野生資源為主，而自然界中雷公藤資源的數(shù)量有限，這就導(dǎo)致雷公藤野生資源日益減少，對(duì)當(dāng)?shù)氐纳锒鄻有院蜕鷳B(tài)平衡造成嚴(yán)重影響。本文對(duì)產(chǎn)雷公藤甲素內(nèi)生真菌的分離、雷公藤內(nèi)生真菌間的交互作用、大孔吸附樹脂對(duì)內(nèi)生真菌合成雷公藤甲素的影響、雷公藤內(nèi)生真菌與內(nèi)生細(xì)菌的相互作用等內(nèi)容進(jìn)行了研究，以期加深對(duì)雷公藤及其內(nèi)生真菌

3、的了解，尋求一條生產(chǎn)雷公藤甲素的有效途徑，保護(hù)雷公藤野生資源。
　　本文主要內(nèi)容如下：
　?。?）雷公藤內(nèi)生真菌的分離鑒定。本研究對(duì)雷公藤內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、純化、液體培養(yǎng)、發(fā)酵液分析檢測，并對(duì)分離到的內(nèi)生真菌進(jìn)行篩選，得到一株產(chǎn)雷公藤甲素的活性菌株NS-1。根據(jù)真菌形態(tài)特征結(jié)合分子生物學(xué)手段，初步確定該菌株為鐮刀菌屬。
　?。?）內(nèi)生真菌互作對(duì)雷公藤甲素合成的誘導(dǎo)作用研究。本研究通過建立內(nèi)生真菌交互共培養(yǎng)體系，篩選出合

4、成雷公藤甲素能力最強(qiáng)的優(yōu)勢組合NS-1+NS-8，其雷公藤甲素合成量是單獨(dú)培養(yǎng)NS-1的1.56倍。后將NS-8制備成不同的粗提物（發(fā)酵液P、菌絲體粗提物Q），添加到指數(shù)生長末期的NS-1中，研究NS-8對(duì)NS-1甲素合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液P極大地促進(jìn)了NS-1對(duì)雷公藤甲素的合成，胞外雷公藤甲素的積累在第7天達(dá)到最大值0.2039μg/ml，為對(duì)照組的4.2倍；菌絲體粗提物Q在誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中不僅沒有促進(jìn)NS-1的生長，反而一定程度上抑

5、制其正常生長，實(shí)驗(yàn)組NS-1的生物量較CK偏小，糖耗速率也較CK偏低，胞外甲素的產(chǎn)量也明顯低于CK，胞內(nèi)甲素的量與CK相近。
　?。?）大孔吸附樹脂對(duì)雷公藤內(nèi)生真菌合成雷公藤甲素的影響。本研究表明利用大孔吸附樹脂對(duì)NS-1發(fā)酵培養(yǎng)體系中的TPL進(jìn)行吸附，能夠明顯促進(jìn)NS-1合成TPL的能力。結(jié)果顯示，在NS-1液體培養(yǎng)第4天，加入2.0g NKA-9型樹脂，吸附30h后收獲對(duì)TPL的吸附效果最好。
　?。?）通過將雷公藤內(nèi)生

6、真菌NS-1與分離到的23株雷公藤內(nèi)生細(xì)菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌LY-3對(duì)NS-1甲素合成具有較好的促進(jìn)作用，兩者共培養(yǎng)所合成的雷公藤甲素是單獨(dú)培養(yǎng)NS-1所合成甲素量的1.41倍。將LY-3制備成不同的誘導(dǎo)子（活性誘導(dǎo)子H、失活誘導(dǎo)子S），添加到指數(shù)生長末期的NS-1中，研究LY-3對(duì)NS-1甲素合成的影響。結(jié)果表明，活性誘導(dǎo)子H的加入促進(jìn)了雷公藤甲素的積累，在加入后的24h培養(yǎng)液中TPL的積累量達(dá)到最大值0.0069ug/ml，為對(duì)照