產(chǎn)熱凝膠糞產(chǎn)堿桿菌的生理代謝研究.pdf

1、熱凝膠是由糞產(chǎn)堿桿菌或土壤桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種新型微生物胞外多糖,其安全無(wú)毒并且具有獨(dú)特的理化性質(zhì),可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域。熱凝膠的發(fā)酵過(guò)程屬于典型的生長(zhǎng)非偶聯(lián)型,發(fā)酵液中氮源耗盡后才開始合成多糖。由于氮源的缺乏,使得熱凝膠合成期間細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的合成及其活性的恢復(fù)受到極大的限制,造成熱凝膠合成速率的降低和發(fā)酵過(guò)程控制的困難。本文以高產(chǎn)熱凝膠糞產(chǎn)堿桿菌WX-C12為研究對(duì)象,運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),對(duì)熱凝膠發(fā)酵過(guò)程中,氮源耗盡前后菌

2、體總蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行了分析和鑒定;并且比較了糞產(chǎn)堿桿菌及其ntrC突變株生理代謝水平的差異,ntrC基因是氮源代謝調(diào)控組分NtrC蛋白的編碼基因,從而對(duì)NtrC蛋白在調(diào)控?zé)崮z合成中的作用有了初步認(rèn)識(shí);另外本文還研究了Mn2+對(duì)熱凝膠合成的影響情況,以了解Mn2+在菌體生理代謝中的作用。
　　 本文首先確立了蛋白分辨率高且重復(fù)性較好的糞產(chǎn)堿桿菌菌體總蛋白雙向電泳圖譜的構(gòu)建方法:使用蛋白質(zhì)裂解液提取菌體總蛋白,然后選擇pH4-7

3、的IPG預(yù)制干膠條和適宜的等電聚焦程序進(jìn)行第一向等電聚焦電泳,最后比較了考馬斯亮藍(lán)和硝酸銀兩種染色方法對(duì)雙向電泳圖譜的影響。
　　 隨后利用上述構(gòu)建的方法分別對(duì)熱凝膠發(fā)酵過(guò)程中氮源耗盡前后的菌體總蛋白進(jìn)行雙向電泳分析,用PDQuest8.0.1軟件分析得電泳圖譜中共有20個(gè)蛋白表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。選取其中5個(gè)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,成功鑒定出3個(gè)已知功能的蛋白,其中烯酰ACP還原酶與菌體生長(zhǎng)受阻有關(guān)。
　　 另外,本文還對(duì)糞

4、產(chǎn)堿桿菌和其ntrC突變株的菌體形態(tài)和熱凝膠生產(chǎn)特性進(jìn)行了比較。與原始菌株相比,ntrC突變株培養(yǎng)18 h后菌體形態(tài)有很大不同;并且其菌體生長(zhǎng)和熱凝膠合成的能力顯著降低,證明了ntrC基因在熱凝膠合成中具有重要的調(diào)控作用。同時(shí)采用雙向電泳技術(shù)對(duì)ntrC突變株和原始菌株的菌體總蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)有約40個(gè)蛋白沒有在ntrC突變株中表達(dá),有43個(gè)蛋白表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。通過(guò)飛行質(zhì)譜成功鑒定得4個(gè)表達(dá)水平顯著變化的蛋白,其中的N-乙酰-γ-谷