不同信號肽對脂肪酶A在枯草芽孢桿菌中分泌表達的影響.pdf

1、脂肪酶(1ipase，EC3.1.1.3)是一類能在油水界面上催化三酯酰甘油水解為甘油和長鏈脂肪酸的酶類，可以催化酯水解、酯交換、酯合成等多種反應(yīng)，并被廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域。來源于芽孢桿菌屬的脂肪酶因其良好的耐熱性和耐堿性而具有較高的研究和應(yīng)用價值。然而在短時間內(nèi)應(yīng)用傳統(tǒng)的誘變野生菌的方法篩選出具有某些特定性質(zhì)的脂肪酶高產(chǎn)菌株是不現(xiàn)實的，所以用基因工程方法生產(chǎn)脂肪酶己成為必然。
　　 枯草芽孢桿菌作為傳統(tǒng)的

2、工業(yè)生產(chǎn)菌，具有極強的蛋白質(zhì)分泌能力，是研究蛋白質(zhì)表達和分泌的良好系統(tǒng)。利用枯草芽孢桿菌信號肽引導(dǎo)外源蛋白質(zhì)定位分泌到細胞特定區(qū)間，可提高外源蛋白質(zhì)的可溶性，避免因包涵體復(fù)性帶來的產(chǎn)物純化等困難。然而，同一種蛋白質(zhì)在不同信號肽的作用下，分泌效率往往相差甚遠，有的甚至不能實現(xiàn)分泌。因此，研究信號肽與目的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，可用以指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)分泌表達中信號肽的選擇，進而為外源蛋白質(zhì)的分泌表達研究奠定基礎(chǔ)。
　　 本文以B.sub

3、tilis168來源的脂肪酶A作為研究對象，構(gòu)建了高效分泌表達載體pMA5△MCS-lipA，并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，得到脂肪酶分泌表達重組菌株WB600(pMA5△MCS-lipA)。經(jīng)20 h搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，分泌到胞外的脂肪酶活力達到最高，為7.64 U/mL，是出發(fā)菌株WB600最高酶活(0.02 U/mL)的382倍。對其生長特性和穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，該重組菌株生長速度和生長量與出發(fā)菌株WB600相當；分離穩(wěn)定性很好，在無選擇壓

4、力的情況下連續(xù)傳100代，細胞仍98％帶有質(zhì)粒；結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究表明重組菌株在無選擇壓力的情況下連續(xù)傳60代，可正確表達lipA基因的重組菌株占總菌株數(shù)的76.5％；傳到100代時，這一比值降到43.6％，但仍可滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。
　　 為了研究不同信號肽對脂肪酶分泌效率的影響，本文還選取了AprE，LipB，WapA，WprA四種蛋白質(zhì)的信號肽序列，替換pMA5△MCS-lipA中l(wèi)ipA基因信號肽序列，構(gòu)建了一系列分泌表達載

5、體。分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，得到重組菌株WB600(pMAaprE-lipA)，WB600(pMAlipB-lipA)，WB600(pMAwapA-lipA)，WB600(pMAwprA-lipA)。各重組菌株發(fā)酵20 h后，脂肪酶分泌表達情況有顯著差異。最高酶活分別達到0.55 U/mL，1.38 U/mL，0.18 U/mL和0.77 U/mL。分別以WB600(pMA5△MCS-lipA)和WB600作為陽性和陰性對照，結(jié)