嗜熱脂肪地芽孢桿菌脂肪酶基因的克隆、表達及酶學性質研究.pdf

1、脂肪酶(三脂酰甘油?；饷?EC 3.1.1.3)廣泛存在于動植物和微生物中,可催化三脂酰甘油的酯鍵水解,也可催化酯化、酯交換、醇解、酸解等反應,在洗滌劑工業(yè)、食品加工、皮革造紙等方面具有廣泛應用.近年來,來自嗜溫和嗜熱微生物的熱穩(wěn)定脂肪酶的基本性質和工業(yè)應用倍受關注,其中主要來源之一是2001年新命名的嗜熱脂肪地芽孢桿菌.但由于野生菌產脂肪酶能力低,主要研究方向集中于采用基因工程方法構建重組菌,通過表達來獲得相應的脂肪酶.本課題亦采

2、用此方法,在大腸桿菌中克隆并表達嗜熱脂肪地芽孢桿菌脂肪酶基因. 本文首先在由胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、NaCl組成的培養(yǎng)基中65℃條件下培養(yǎng)野生型嗜熱脂肪地芽孢桿菌,收集菌體后采用合適的方法提取野生菌基因組作為PCR擴增模板,Pfu酶作DNA聚合酶,擴增得到約1.3kb條帶,與pMD18-T Simple Vector連接進行TA克隆測序,驗證目的基因得到正確擴增. 表達載體pET28c(+)及TA陽性克隆用Bam

3、HⅠ、NdeⅠ雙酶切后,經T4DNA連接酶連接構建得到堿基數(shù)為6590bp的重組質粒pET28c(+)-lipase,在DH5a中得到高效擴增. 克隆成功后,將重組質粒轉化E coli BL21(DE3)中表達,經SDS電泳與脂肪酶活性測定驗證脂肪酶得到有效表達.對重組菌表達條件進行優(yōu)化,培養(yǎng)至OD600在1.0左右,加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L,28℃誘導6小時,以橄欖油為底物,脂肪酶酶活達到1.88U/mg.