木瓜凝乳蛋白酶的化學修飾研究.pdf

1、木瓜凝乳蛋白酶(Chymopapain，EC3.4.22.6，Cp)是木瓜乳中含量最高、水解和凝乳活性最強的一種巰基蛋白酶。該酶除了在食品工業(yè)具有廣泛的應(yīng)用外，還具有非常重要的醫(yī)藥價值，其中以注射治療椎間盤突出癥的臨床應(yīng)用最為確切和成功。然而由于該酶體內(nèi)半衰期短且易引發(fā)免疫反應(yīng)而降低了該酶的臨床應(yīng)用效果。為此，作者開展了木瓜凝乳蛋白酶化學修飾的研究。本研究首先從商品木瓜蛋白酶粗品中分離純化出木瓜凝乳蛋白酶純品，再用活化的無免疫原性的單甲

2、氧基聚乙二醇(mPEG-5000)為修飾劑，對Cp進行了共價修飾。通過實驗篩選出最佳的修飾反應(yīng)條件，進一步對修飾產(chǎn)物進行了檢測與分析，并對Cp在修飾前后的主要酶學、藥物生物學性質(zhì)等進行了比較研究。　　本研究以未激活的木瓜蛋白復(fù)合酶為上樣酶液，以磷酸鹽緩沖液為洗脫液進行離子強度和pH的線性雙梯度洗脫。經(jīng)CMC離子交換柱層析、超濾等純化步驟，獲得了產(chǎn)物均一、比活力為3389.1U/mg、酶活力回收率達68.9％、蛋白回收率達64.1％的C

3、p純酶，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢驗達電泳純?！　≡趍PEG化學修飾的研究中，需對不同修飾產(chǎn)物的抗原性進行免疫學檢測?？乖贵w的特異性結(jié)合是免疫學檢測技術(shù)的基礎(chǔ)，為此，開展了Cp多克隆抗體制備及分析、檢測的研究。結(jié)果表明，抑活抗原比未處理原酶具有更好的免疫原性。以抑活的Cp為抗原，采用多次皮下注射和一次靜脈沖擊免疫相結(jié)合的方式制備出的Cp抗體，經(jīng)Westernblotting法鑒定和ELISA法檢測，其抗血清效價為106。同時，用ELI

4、SA法預(yù)先測定出用于各修飾酶抗原性檢測的抗原、抗體的最佳工作濃度分別為1：400和1：500?！　”狙芯恐苽涑鰞煞NmPEG活化產(chǎn)物：mPEG1和mPEG2，這兩種mPEG衍生物對蛋白酶的修飾效果不同。通過mPEG1、mPEG2對Cp修飾效果的比較得出，由于空間位阻效應(yīng)較大，Cp經(jīng)mPEG2修飾后對大分子底物的接近及催化能力明顯減弱，因而在實際臨床應(yīng)用中不利于藥效的發(fā)揮，因此，選用mPEG1為Cp的修飾劑。　　通過實驗，進一步篩選出m

5、PEG1修飾Cp的最佳修飾反應(yīng)條件：即在ATEE底物保護下，每10mg酶蛋白與0.8gmPEG1在pH值為9.0的硼酸緩沖液中4℃反應(yīng)1h，可得抗原抗體結(jié)合力完全消失，而酶活力可達36％～40％的修飾酶?！　∶毠茈娪痉治鼋Y(jié)果表明：在本研究篩選出的修飾反應(yīng)條件下，mPEG1對Cp的共價修飾產(chǎn)物為多組分體系，最大產(chǎn)物峰為平均每分子Cp偶聯(lián)3～4個mPEG1鏈的低修飾度產(chǎn)物峰。紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜分析表明：該mPEG1修飾酶的結(jié)構(gòu)有

6、輕度改變。收集此低修飾度產(chǎn)物進一步作酶學及藥物生物學性質(zhì)等方面的研究?！　∶资铣?shù)計算結(jié)果顯示，Cp經(jīng)mPEG1修飾后，Kmapp(酪蛋白為底物)有所增加，表明mPEG1修飾酶與底物的親和力有所減弱，但與Cp相比，mPEG1修飾酶的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性以及抗胰蛋白酶的水解能力均有所增強，體內(nèi)半衰期延長，表明mPEG1修飾酶具有更好的應(yīng)用前景?！　【C上所述，通過對木瓜凝乳蛋白酶的mPEG化學修飾，消除了天然酶的免疫原性、延長了酶的體內(nèi)