菠蘿蛋白酶提取純化及化學(xué)修飾對(duì)其活性的影響

1、菠蘿蛋白酶提取純化及化學(xué)修飾對(duì)其活性的影響菠蘿蛋白酶提取純化及化學(xué)修飾對(duì)其活性的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握菠蘿蛋白酶的提取和純化方法2、研究菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定性3、掌握菠蘿蛋白酶的化學(xué)修飾并對(duì)修飾酶與未修飾酶的活性比較二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理菠蘿蛋白酶（BromelainEC3.4.22.3）是從鳳梨屬植物菠蘿中提取的一組復(fù)合的半胱氨酸巰基蛋白水解酶。菠蘿蛋白酶屬于糖蛋白，分子量約為33000D，等電點(diǎn)為9.55，白色至淺棕黃色

2、無(wú)定形粉末，溶于水。水溶液無(wú)色至淡黃色，有時(shí)有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。菠蘿蛋白酶是典型的巰基蛋白酶，能分解蛋白質(zhì)，肽，酯，酰胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十倍以上，因此有著廣泛的用途。它作為一種食品添加劑可用于肉質(zhì)嫩化、啤酒澄清，還用于干酪、明膠、水解蛋白酶的生產(chǎn)。在醫(yī)藥上它可用于生物體內(nèi)溶解纖維蛋白及血凝塊，因此可用于治療水腫及多種炎癥；它能迅速溶痂，對(duì)正常組織無(wú)害，不影響植皮，適用于中小面積深度燒傷的治療。菠蘿蛋

3、白酶的最適溫度范圍比較穩(wěn)定，最穩(wěn)定范圍是55℃~65℃。菠蘿蛋白酶的最適pH在7.1左右，呈現(xiàn)中性。金屬鹽離子中NaCl、KCl對(duì)酶活的影響不是很大，較高濃度的MgCl2、CaCl2對(duì)菠蘿蛋白酶單寧復(fù)合物有一定程度的抑制作用，尤其在濃度較高的情況下對(duì)菠蘿蛋白游離酶酶活的影響更大。Zn2的作用中以醋酸鋅的作用更為顯著，極低的濃度即能促使菠蘿蛋白酶的酶活性明顯提高。較低濃度的ZnCl2也能使酶的穩(wěn)定性有所提高。維生素C、半胱氨酸、硫代硫酸鈉

4、、2巰基乙醇是菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定劑，都能使酶分子中巰基基團(tuán)維持還原態(tài)，能夠作為還原劑來(lái)提高酶活力。0.05%的苯甲酸鈉即能使氧化脫氫酶的活性得到抑制，對(duì)酶起到保護(hù)作用。對(duì)酶活有影響的金屬離子，EDTA能通過(guò)螯合而保護(hù)菠蘿蛋白酶，消除其對(duì)酶的失活作用。其它試劑如50%的甘油、葡萄糖、40%的半乳糖都能使菠蘿蛋白酶的半衰期延長(zhǎng)，蔗糖、麥芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均對(duì)菠蘿蛋白酶有一定的保護(hù)作用。菠蘿蛋白酶含有1個(gè)巰基和4個(gè)內(nèi)肽二硫鍵。

5、在蛋白質(zhì)中—SH部分是與酶活性有關(guān)的最具有反應(yīng)性的官能團(tuán)，巰基能夠和N取代馬來(lái)酰亞胺反生加成反應(yīng)，可以對(duì)巰基進(jìn)行修飾，驗(yàn)證巰基對(duì)酶催化活性的影響NCOOHOSHNCOOHOS三、試劑材料三、試劑材料1、材料：新鮮的成熟菠蘿2、儀器：榨汁機(jī)、離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、氯化鈣的干燥器、CM瓊脂糖凝膠柱（1.1cm30.0cm）、研缽、滴管（大、?。?、燒杯（大、中、?。⒃嚬?、具塞試管、白瓷板、溫度計(jì)、PH計(jì)、攪拌棒。略微增大層析柱

6、出口的流速，排除凝膠床表面緩沖液。打開(kāi)層析柱頂塞，用移液管將透析至無(wú)SO42的酶蛋白溶液沿管壁從凝膠床表面上數(shù)毫米處緩慢流下。打開(kāi)層析柱出口，讓蛋白質(zhì)樣品溶液進(jìn)入凝膠柱床內(nèi)，待液面重合時(shí)，可用少許起始緩沖液洗柱內(nèi)壁和床表面，關(guān)上層析柱出口。1.4.4.洗脫加樣后用足夠量的起始緩沖液淋洗，使未吸附的物質(zhì)被洗出，并達(dá)到充分平衡，在凝膠表面緩慢滴加洗脫液，加至洗脫液表面與柱口形成凸面，加入1MNaCl20mMpH4.0醋酸緩沖液（含0.01%

7、EDTA）以1mLmin流速，開(kāi)始洗脫，1.4.5.收集將洗脫液按一定的體積分別收集于試管中，收集各吸收峰洗脫液，然后逐管進(jìn)行分析，合并活性洗脫峰透析冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?.酶活性的測(cè)定2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定取干燥潔凈試管，按如下要求操作加入試劑：0123456酪氨酸(mL)00.511.522.53PBS(mL)54.543.532.52酶激活劑(mL)111111137℃水浴保溫5min蛋白酶液(mL)111111137℃水浴保溫15m

8、in三氯醋酸(mL)555555537℃水浴保溫5min于13000rpm離心1min，取上清液，在721型分光光度計(jì)上以275nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度值A(chǔ)，記錄數(shù)據(jù)。然后以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，紫外吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線待用。2.2樣品酶活性測(cè)定取干燥潔凈試管，按如下要求操作加入試劑：樣品對(duì)照酪蛋白5mL酪蛋白5mL酶激活劑1mL酶激活劑1mL37℃水浴保溫5min酶液1mL三氯醋酸5mL37℃水浴保溫15min三氯醋酸5mL酶液1