達(dá)托霉素生物合成基因族異源表達(dá)及調(diào)控機(jī)制初步研究.pdf

1、達(dá)托霉素是從玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵液中分離的一種具有環(huán)脂肽結(jié)構(gòu)的新型抗生素，結(jié)構(gòu)新穎，作用機(jī)制特殊，對革蘭氏陽性菌有較好的抑菌效果。其獨(dú)特的環(huán)脂肽結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制，使其將不會(huì)受到來自其它抗生素所致交叉耐藥性的影響，具有廣闊的市場前景。達(dá)托霉素屬于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，其生物合成基因是以“基因簇”的形式存在的，全長128kb，經(jīng)細(xì)胞非核糖體途徑合成。非核糖體途徑的肽合成不依賴mRNA為模板，也不以tRNA為載體，而是通過非核糖體肽鏈合成酶(NRPS

2、s)識(shí)別特定的氨基酸并連接成多肽。
　　 目前，達(dá)托霉素的制備方法主要有天然發(fā)酵法、前體誘導(dǎo)法、化學(xué)合成、酶法半合成等，由于達(dá)托霉素特有的環(huán)脂肽結(jié)構(gòu)，并且含有特殊氨基酸成分，因而微生物發(fā)酵生產(chǎn)達(dá)托霉素還是目前較為常用的方法。但是此方法的達(dá)托霉素表達(dá)量較低，無法滿足產(chǎn)業(yè)化需求，對該生產(chǎn)菌進(jìn)行改造，提高達(dá)托霉素表達(dá)水平是很有必要的。
　　 此外，合成生物學(xué)的飛速發(fā)展對抗生素的篩選、改造和制備提供了全新的思路。合成生物學(xué)以系統(tǒng)

3、化設(shè)計(jì)和工程化構(gòu)建為理念，旨在對多種天然的或人工設(shè)計(jì)的生物學(xué)元件進(jìn)行合理而系統(tǒng)的組合以獲得重構(gòu)的或非天然的“生物系統(tǒng)”。目前達(dá)托霉素生物合成途徑及相關(guān)功能基因已經(jīng)被成功解析，應(yīng)用合成生物學(xué)技術(shù)可以對其生物合成基因簇進(jìn)行人為的遺傳操作，如通過基因替換篩選新型抗生素、通過更改宿主提高表達(dá)量等等。但目前國內(nèi)合成生物學(xué)研究還屬于起步階段，尚無對超大DNA片段，尤其是來源于鏈霉菌的大片段DNA進(jìn)行遺傳操作的成功報(bào)道。
　　 為了掌握合成生

4、物學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)體系，尤其是大片段基因的操作技術(shù)，為后續(xù)的達(dá)托霉素合成生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，本研究一方面通過對達(dá)托霉素原始生產(chǎn)菌(ATCC31568)進(jìn)行紫外誘變結(jié)合抗生素抗性篩選處理，初步提高達(dá)原始生產(chǎn)菌的生產(chǎn)能力，并建立系統(tǒng)的發(fā)酵培養(yǎng)、分離純化、分離檢測技術(shù)。同時(shí)通過構(gòu)建達(dá)托霉素生產(chǎn)菌----玫瑰孢鏈霉菌基因組BAC文庫，篩選達(dá)托霉素合成基因簇，利用接合轉(zhuǎn)移的方法，實(shí)現(xiàn)達(dá)托霉素在變鉛青鏈霉菌中的表達(dá)，以掌握大片段基因操作技術(shù)。
　

5、　 本論文利用大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型pESPBAC質(zhì)粒構(gòu)建了包含24塊96孔板共2304個(gè)克隆組成的玫瑰孢鏈霉菌基因組BAC文庫，插入片段大于140kb。利用達(dá)托霉素合成基因簇特異性引物進(jìn)行PCR篩選，成功篩選到含有完整達(dá)托霉素合成基因簇的BAC質(zhì)粒，命名為pESPBAC-DAP。并利用其在大腸桿菌和鏈霉菌之間的可穿梭性，將pESPBAC-DAP質(zhì)粒先電轉(zhuǎn)入E.coliET12567(pUZ8002)中，利用大腸桿菌和鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移

6、作用，在輔助質(zhì)粒pUZ8002的輔助下，將達(dá)托霉素合成基因簇轉(zhuǎn)移至變鉛青鏈霉菌TK24中，由于pESPBAC載體上存在噬菌體基因組attP位點(diǎn)，在鏈霉菌噬菌體(φ)C31的整合酶int作用下，與鏈霉菌基因組中的attB位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn)特異性重組，將達(dá)托霉素合成基因簇整合到變鉛青鏈霉菌TK24基因組中。對整合后的變鉛青鏈霉菌TK24進(jìn)行發(fā)酵，利用HPLC檢測到達(dá)托霉素的表達(dá)，表達(dá)量為30.2mg/L，并對其活性進(jìn)行檢測。
　　 通過紫

7、外誘變加大出發(fā)菌株突變率的同時(shí)，使用利福平(Rifampicin)和慶大霉素（Gentamicin）進(jìn)行抗性篩選，進(jìn)一步改良菌株，增加了菌株的抗性標(biāo)記，快速、有效地提高了菌株的生產(chǎn)能力。篩選到的突變株Ge-27最高產(chǎn)量達(dá)到79.44mg/L，比原始菌株提高了42.2％，與原始菌株相比，Ge-27發(fā)酵單位有明顯提高。說明采用紫外誘變結(jié)合抗生素抗性篩選可以高效提升達(dá)托霉素生產(chǎn)水平;
　　 通過對達(dá)托霉素部分ORFs進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR

8、分析后，初步篩選到ORF-12、ORF-53、ORF-21、ORF-31和ORF-22這五個(gè)ORF在其生物合成過程中發(fā)揮調(diào)控作用，其中ORF-12、ORF-21和ORF-53這三個(gè)ORFs在達(dá)托霉素合成過程中的初始階段有可能起到限速作用;ORF-31能在達(dá)托霉素后期合成過程中起到正調(diào)控作用;ORF-22在達(dá)托霉素生物合成過程中可能起到負(fù)調(diào)控的作用，為下一步對單個(gè)ORF的功能分析，或者對某一ORF進(jìn)行敲除或者過表達(dá)以提高達(dá)托霉素生產(chǎn)水平奠