基于抗生素基因?yàn)閳?bào)告基因的核酸酶效力檢測.pdf

1、目的：
　　探究基因編輯工具剪切效率和脫靶效應(yīng)評估新方法，開發(fā)新的基因編輯工具剪切效率和脫靶效應(yīng)評估新體系。
　　方法：
　　選取質(zhì)粒中博來霉素抗性基因作為實(shí)驗(yàn)候選報(bào)告基因。在原核系統(tǒng)構(gòu)建Amp-Zeocin雙抗質(zhì)粒。同時(shí)在Zeocin抗性基因起始密碼子ATG與第二密碼子GCC間加入BaeI酶切位點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)金門克隆插入核酸片段方法。在真核體系構(gòu)建G418/Kana-Zeocin雙抗質(zhì)粒，同時(shí)也在Zeocin抗性基因起始

2、密碼子ATG與第二密碼子GCC間加入BaeI酶切位點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)金門克隆插入核酸片段方法。在候選報(bào)告基因中加入不同長度（包括3的整數(shù)倍和非3的整數(shù)倍）、不同種類（含有終止密碼子和不含有終止密碼子，指定序列和任意序列）的核酸片段，觀察其抗性的保留與否；將人工構(gòu)建的失活抗性基因使用基因編輯工具造成雙鏈斷裂，加入同源oligo，促使其在E.coil中發(fā)生同源重組重新恢復(fù)活性，驗(yàn)證其抗性功能的轉(zhuǎn)換能力。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建雙抗質(zhì)粒