基于雙熒光素酶報告基因檢測環(huán)境致癌物DNA損傷修復作用.pdf

1、目的:隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，越來越多的化合物投入生產(chǎn)。如此眾多的化學物質(zhì)中，致癌化學物質(zhì)占有相當?shù)谋壤?。近年來，我國腫瘤發(fā)病率升高明顯，顯然與環(huán)境致癌物的污染有關(guān)。在基因組的遺傳穩(wěn)定中，DNA損傷與修復具有十分重要的地位，因此對DNA損傷修復的檢測也已經(jīng)成為遺傳毒物對生物體早期損傷的生物標記。目前已有多種不同的檢測方法應用于環(huán)境致癌物對DNA損傷或修復的檢測。常用檢測DNA損傷的實驗有微核實驗、染色體畸變和彗星實驗等。最近報道，可利用誘導基

2、因結(jié)合靈敏的報告基因檢測DNA損傷，常用的誘導基因有RAD51，RAD54和gadd153等。檢測DNA修復的方法主要有彗星實驗和宿主細胞恢復活性實驗(HCR)。HCR是一種細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染受損質(zhì)粒，檢測受損質(zhì)粒的修復情況，以反應細胞對DNA的修復能力。然而上述檢測方法均為分別檢測DNA損傷或DNA修復作用。由于DNA受到損傷的同時可即刻啟動細胞修復系統(tǒng)進行修復，所以僅僅單獨檢測DNA損傷或者修復能力并不能準確評價外來化學物質(zhì)對細胞DNA的損

3、傷作用。為系統(tǒng)評價環(huán)境致癌物對DNA的損傷和修復作用，本研究利用誘導基因GADD153-LUC檢測方法結(jié)合HCR檢測原理建立一種可同時檢測外源化學物質(zhì)對DNA損傷和修復作用的方法。
　　 方法:
　　 1細胞培養(yǎng)
　　 人肝母細胞瘤細胞株HepG2(中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心)于含10％熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)。利用RNA干擾技術(shù)，建立XRCC1低表達細胞株，于10％熱滅

4、活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)。選對數(shù)生長期的細胞進行實驗。
　　 2載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
　　 pGadd153-LUC質(zhì)粒是一種包括gadd153啟動子和熒光素酶報告基因的載體，本實驗室已構(gòu)建成功。pRL-TK質(zhì)粒是一種包含SV40啟動子和海腎熒光素酶報告基因的載體，購買于Clontech公司。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，用胰酶消化后輕柔吹打制成單細胞懸液，并計數(shù)。按2×105個/ml接種

5、細胞于6孔培養(yǎng)板，于含10％FCS血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，待細胞匯合度達95％時，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染細胞。
　　 3宿主細胞恢復活性實驗(HCR)
　　 氯化鎘損傷質(zhì)粒pRL-TK，乙醇沉降法回收受損質(zhì)粒，TE溶解沉淀，質(zhì)粒濃度定容為1μg/μl。瞬時轉(zhuǎn)染受損質(zhì)粒和pGL3-LUC質(zhì)粒，不同致癌物染毒12小時后，檢測熒光強度，同時檢測樣品蛋白含量，以熒光強度/μg蛋白含量，來反應DNA修復能力。
　　 4雙熒

6、光素酶報告基因檢測
　　 受損質(zhì)粒和pGadd153-LUC共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染后以不同化學物質(zhì)對細胞進行染毒，12小時后收獲細胞。采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測樣品中雙熒光素酶的表達情況。檢測樣品蛋白含量，以熒光強度/μg蛋白含量分別表示蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的表達量。
　　 5彗星實驗
　　 彗星實驗是一種傳統(tǒng)的DNA損傷修復的檢測方法。本研究分別比較彗星實驗與Gadd153-Luc檢測方法及H

7、CR實驗的檢測靈敏度。
　　 6土壤中非揮發(fā)性有機化合物的檢測
　　 土壤樣品分別采集于3個不同污染程度的電子垃圾污染區(qū)（居民區(qū)，垃圾焚燒廠，農(nóng)田），有機溶劑抽提法抽提土壤樣品中非揮發(fā)性的有機物。以雙熒光素酶報告基因檢測法和彗星實驗檢測提取物對HepG2細胞DNA的損傷與修復作用。
　　 結(jié)果:
　　 1宿主細胞恢復活性實驗最佳實驗條件的選擇
　　 氯化鎘處理質(zhì)粒的劑量與熒光素酶表達以及質(zhì)粒受損的

8、時間和熒光素酶表達的結(jié)果顯示，5μmol/L氯化鎘處理pRL-TK質(zhì)粒2小時后轉(zhuǎn)染HepG2細胞可使約90％的DNA損傷修復。相同劑量和時間處理質(zhì)粒轉(zhuǎn)染修復基因缺陷的細胞XRCC1(-)細胞，僅有60％的損傷可被修復。因此，本研究選擇5μmol/L氯化鎘處理PRL-TK質(zhì)粒2小時后轉(zhuǎn)染細胞進行DNA修復能力的檢測。
　　 2宿主細胞恢復活性實驗檢測已知環(huán)境致癌物對HepG2細胞DNA修復能力的影響
　　 宿主細胞恢復活性

9、試驗檢測7種已知環(huán)境致癌物對HepG2細胞DNA修復能力的影響，并與彗星實驗結(jié)果進行比較。結(jié)果顯示，HCR對其中5種環(huán)境致癌物影響DNA修復能力的檢測限值要低于彗星實驗的檢測限值。其中對于苯并芘，HCR的檢測限值比彗星實驗低1000倍，對于氯化鎘，HCR的檢測限值比彗星實驗低10倍。
　　 3雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測環(huán)境致癌物的DNA損傷修復能力
　　 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測16種已知環(huán)境致癌物對DNA損傷與修

10、復能力的影響。海腎熒光素酶的表達情況反應細胞對DNA的修復能力，蟲熒光素酶的表達情況反應DNA的損傷情況。結(jié)果顯示，16種有遺傳毒性的環(huán)境致癌物，雙熒光素酶報告基因的檢測限值與單獨gadd153-LUC檢測系統(tǒng)或者HCR的檢測限值，基本相同。本研究選擇3種無遺傳毒性的化學物質(zhì)，利用雙熒光素酶系統(tǒng)進行檢測，均未見DNA損傷作用和對DNA修復能力的影響。
　　 4雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測土壤中非揮發(fā)性有機物提取物對HepG2細胞D

11、NA損傷和修復的作用
　　 來自三個不同污染區(qū)的土壤中非揮發(fā)性有機提取物均可誘導蟲熒光素酶報告基因的表達，說明該土壤中非揮發(fā)性有機物可誘導DNA損傷，強度為居民區(qū)＞垃圾焚燒廠＞農(nóng)田土壤;同時該有機提取物可降低海腎熒光素酶報告基因的表達，說明土壤中非揮發(fā)性有機物具有降低DNA修復能力的作用，強度為居民區(qū)＜垃圾焚燒廠＜農(nóng)田土壤。彗星實驗檢測土壤中非揮發(fā)性有機提取物對DNA的損傷情況。彗星實驗的結(jié)果與雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)

12、果一致。
　　 結(jié)論:
　　 1本研究建立了可同時檢測環(huán)境致癌物對DNA損傷與修復能力的雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)。
　　 2環(huán)境致癌物對DNA的損傷修復情況，可以通過檢測蟲熒光素酶的表達活性來反應細胞DNA受損的程度，檢測海腎熒光素酶的表達活性來反映DNA的修復水平。
　　 3應用重組細胞系統(tǒng)對多種致癌物和環(huán)境樣品進行DNA損傷與修復能力的檢測，本研究結(jié)果表明該檢測系統(tǒng)對大部分致癌物質(zhì)和實際環(huán)境樣品均有