氯噻啉免疫分析方法研究.pdf

1、氯噻啉是南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司研發(fā)的一種高效、低毒、廣譜的新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑，廣泛用于控制煙粉虱、薊馬、蚜蟲(chóng)、葉蟬和其他植食性害蟲(chóng)。高效液相色譜法(HPLC)是常見(jiàn)的氯噻啉檢測(cè)方法，然而儀器檢測(cè)存在設(shè)備昂貴、有機(jī)溶劑使用量大、操作程序復(fù)雜和難以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)等問(wèn)題。本研究建立了基于氯噻啉單克隆抗體的熒光偏振免疫分析方法(FPIA)、時(shí)間分辨熒光免疫分析方法(TRFIA)、量子點(diǎn)熒光免疫分析方法(FLISA)和增敏型金標(biāo)試紙條免疫層析分

2、析方法(Enhanced-GICA)，并且應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中氯噻啉的快速檢測(cè)。
　　基于氯噻啉單克隆抗體(MAb)建立了時(shí)間分辨熒光免疫分析方法（TRFIA），并對(duì)包被抗原、銪標(biāo)抗體的工作濃度和工作緩沖液進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)條件下，標(biāo)準(zhǔn)曲線的抑制中濃度(IC50)和最低檢測(cè)限(IC10)分別為9.37 ng/mL和0.024 ng/mL。建立的TRFIA僅對(duì)吡蟲(chóng)啉有較大交叉反應(yīng)(36.05％)，其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率均小于

3、0.2％，表明建立的TRFIA對(duì)氯噻啉具有較高的特異性。在番茄、梨、大米、甘藍(lán)、黃瓜、蘋(píng)果和河水中的平均添加回收率在81.3％-117.7％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2％-6.9％之間。TRFIA法檢測(cè)未知樣品中氯噻啉殘留的結(jié)果與HPLC的檢測(cè)結(jié)果具有高度相關(guān)性，水樣品和梨樣品中的相關(guān)系數(shù)(R2)分別0.9920和0.9699。建立的氯噻啉TRFIA法比基于同種抗體的FPIA法靈敏度提高了9倍，可以作為農(nóng)產(chǎn)品中氯噻啉殘留檢測(cè)的一種理想分析

4、工具。
　　利用氯噻啉單克隆抗體建立了氯噻啉量子點(diǎn)熒光免疫分析方法(FLISA)，并對(duì)包被抗原、QD標(biāo)記抗體的工作濃度和工作緩沖液進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)條件下，標(biāo)準(zhǔn)曲線的抑制中濃度(IC50)和最低檢測(cè)限(IC10)分別為23.63 ng/mL和0.45 ng/mL。建立的FLISA僅對(duì)吡蟲(chóng)啉有較大交叉反應(yīng)(33.53％)，其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率均小于0.2％，表明建立的FLISA對(duì)氯噻啉具有較高的特異性。在番茄、梨、大米、甘藍(lán)、

5、黃瓜、蘋(píng)果和河水中的平均添加回收率在72.7％-117.6％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.4％-13.5％之間。FLISA法檢測(cè)未知樣品中氯噻啉殘留的結(jié)果與HPLC的檢測(cè)結(jié)果具有高度相關(guān)性，水樣品和梨樣品中的相關(guān)系數(shù)(R2)分別0.9806和0.9979。本研究建立的FLISA法具有靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能夠應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中氯噻啉的高通量檢測(cè)。
　　利用氯噻啉單克隆抗體建立了熒光偏振免疫分析方法(FPIA)，并對(duì)熒光示蹤物、抗體的工

6、作濃度和工作緩沖液進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)條件下，標(biāo)準(zhǔn)曲線的抑制中濃度(IC50)和最低檢測(cè)限(IC10)分別為87.94 ng/mL和0.57 ng/mL。建立的FPIA僅對(duì)吡蟲(chóng)啉有較大交叉反應(yīng)(96.87％)，表明建立的FPIA對(duì)氯噻啉具有較高的特異性。在番茄、梨、大米、甘藍(lán)、黃瓜、蘋(píng)果和河水中的平均添加回收率在83.3％-117.3％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.4％-12.0％之間。FPIA法檢測(cè)未知樣品中氯噻啉殘留的結(jié)果與HPLC的檢測(cè)結(jié)

7、果具有高度相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9942，證明本研究建立的FPIA方法具有較高的可靠性與準(zhǔn)確性，可用于農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中氯噻啉快速檢測(cè)。
　　基于單克隆抗體和生物素-鏈霉親和素的高親和作用，建立了增敏型氯噻啉金標(biāo)試紙條免疫層析分析方法(GICA)。在最佳優(yōu)化條件下，可以在10分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)可視化判讀，最低檢測(cè)限為50 ng/mL。建立的GICA方法除了對(duì)吡蟲(chóng)啉有較大交叉反應(yīng)外，與其他類(lèi)似化合物基本無(wú)交叉反應(yīng)。研究中，使用GIC