苯噻菌酯殘留免疫分析方法研究.pdf

1、苯噻菌酯（benzothiostrobin）是由華中師范大學研發(fā)的一種新型甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。苯噻菌酯具有殺菌譜廣，殺菌活性高，施用量低，持效期長等優(yōu)點，具有保護及治療作用，對作物白粉病、霜霉病均表現(xiàn)出優(yōu)越的防效，具有良好的市場開發(fā)前景。為了進一步研究苯噻菌酯的安全使用、殘留控制及最大殘留限量（MRL）的確定，本研究建立了能定量檢測苯噻菌酯的高效液相色譜分析方法，同時依據(jù)苯噻菌酯特異性單克隆抗體，建立了酶聯(lián)免疫分析和免疫層析分析方法

2、。
　　采用高效液相色譜法，使用C18反相色譜柱，以乙腈-三氟乙酸水溶液(65∶35，V/V)為流動相，流速為0.8 mL/min，在UV230 nm下，對苯噻菌酯進行定量測定。在0.1～10 mg/L范圍內，苯噻菌酯濃度與色譜峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)為0.9999，相對標準偏差為0.332％，平均回收率為102.7％。
　　通過對苯噻菌酯進行水解合成了苯噻菌酯半抗原，將苯噻菌酯半抗原與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備了

3、免疫原，與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備了包被抗原。經(jīng)紫外光譜分析證明人工抗原偶聯(lián)成功，免疫原和包被原的結合比分別為17∶1和8∶1。免疫BALB/c小鼠獲得相應的單克隆抗體。當包被抗原的濃度為4 mg/L時，單克隆抗體的效價達到6.3×106。
　　利用制備的特異性單克隆抗體建立了能夠用于檢測苯噻菌酯殘留的酶聯(lián)免疫分析方法。通過對工作濃度、甲醇含量、離子強度、pH值的優(yōu)化，確定了抗原抗體的最佳反應條件。在最佳優(yōu)化條件下（5％甲醇PB

4、S溶液、Na+0.3 M、pH6.5），該方法檢測苯噻菌酯的抑制中濃度(IC50)和最低檢測濃度(ICl0)為7.55和0.428μg/L。建立的ic-ELISA除了對吡唑醚菌酯有交叉反應外(0.34％)，與苯噻菌酯結構類似化合物沒有明顯的交叉反應。稻田水、土壤、番茄、大米和梨中的平均添加回收率為80.43～113.83％，滿足苯噻菌酯殘留檢測要求。真實樣品的檢測結果表明ELISA與高效液相色譜法具有高度的相關性(y=1.0867x+0

5、.0318，R2=0.9894)。證明建立的ic-ELISA能夠高靈敏地檢測農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中苯噻菌酯的殘留。
　　在金標抗體和最優(yōu)半抗原的基礎上，制備了免疫層析試紙條，并建立了一種可以快速（5分鐘）、簡便的檢測不同樣品中苯噻菌酯的免疫層析分析方法(ICA)。在最優(yōu)條件下，所建立的ICA對苯噻菌酯的100％抑制濃度為0.1 mg/L，最低檢測限0.05mg/L。通過對7種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑交叉反應的研究，建立的ICA對苯噻菌酯