熒光假單胞菌PCR檢測(cè)靶點(diǎn)的篩選及PCR檢測(cè)體系的建立.pdf

1、熒光假單胞菌（Pseudomonas Fluorescens）是一種嗜冷微生物，在冷藏的生肉、生牛乳等高蛋白高脂肪的食品中是導(dǎo)致腐敗的優(yōu)勢(shì)菌種。免疫缺陷病患者被熒光假單胞菌感染血液，可能導(dǎo)致敗血癥等嚴(yán)重后果，屬于典型的“條件致病菌”。隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的變化，熒光假單胞菌對(duì)人類健康的潛在威脅日益擴(kuò)大。建立快速、準(zhǔn)確的熒光假單胞菌檢測(cè)方法對(duì)完善食品安全監(jiān)測(cè)體制有重要的意義。
　　PCR技術(shù)因其具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，反

2、應(yīng)快速等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用在食源性致病微生物的檢測(cè)領(lǐng)域。針對(duì)熒光假單胞菌的PCR檢測(cè)仍處于初級(jí)階段。目前檢測(cè)熒光假單胞菌的種特異性基因靶點(diǎn)很少，且缺乏系統(tǒng)評(píng)價(jià)。本研究將通過(guò)生物信息學(xué)手段，尋找新的種特異性的檢測(cè)靶點(diǎn)，針對(duì)這些靶點(diǎn)以及16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列與gyrB基因設(shè)計(jì)和篩選出新的種特異性強(qiáng)的引物，建立和優(yōu)化熒光假單胞菌PCR檢測(cè)體系，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。
　　首先通過(guò)比對(duì)熒光假單胞菌及其它原核生物的基因組序列，

3、發(fā)掘出4段熒光假單胞菌特異性片斷作為候選分子檢測(cè)靶點(diǎn)，同時(shí)也對(duì)16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列、gyrB基因進(jìn)行信息學(xué)分析。對(duì)上述6個(gè)分子靶點(diǎn)分別設(shè)計(jì)常規(guī)PCR引物，并經(jīng)實(shí)際實(shí)驗(yàn)特異性初篩，選取gyrB基因?yàn)闄z測(cè)靶點(diǎn)，建立常規(guī)PCR和熒光定量PCR檢測(cè)體系，并進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果如下：
　　1.熒光假單胞菌常規(guī)PCR檢測(cè)體系：
　　1) PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：通過(guò)對(duì)退火溫度、Mg2+濃度的優(yōu)化選擇，建立相應(yīng)的熒光假單胞菌

4、常規(guī)PCR檢測(cè)體系；
　　2)特異性：經(jīng)11株熒光假單胞菌和28株非熒光假單胞菌驗(yàn)證，該體系擴(kuò)增熒光假單胞菌基因組DNA可得到一條271 bp的特異性條帶，擴(kuò)增非熒光假單胞菌基因組DNA則無(wú)條帶；
　　3)靈敏度：純DNA檢測(cè)靈敏度為14.3 fg/μL(2~3 copies/μL)，純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度為3.0×102 CFU/mL；向25 mL無(wú)菌豆奶樣品中添加2.2 CFU熒光假單胞菌時(shí)，增菌15 h可檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果，整

5、個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在18 h內(nèi)完成；
　　4)抗干擾能力：當(dāng)背景干擾菌總量達(dá)到108 CFU/mL時(shí)，經(jīng)過(guò)15 h增菌培養(yǎng)，可準(zhǔn)確檢測(cè)熒光假單胞菌的存在；
　　5)檢出率：5種（56份）實(shí)際樣品中熒光假單胞菌檢出率為19.6％，高于培養(yǎng)法的檢出率1.8%。
　　2.基于TaqMan探針的熒光定量PCR檢測(cè)熒光假單胞菌體系：
　　1) PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：通過(guò)對(duì)退火溫度、探針濃度的優(yōu)化選擇，建立相應(yīng)的熒光假單胞菌熒光定

6、量PCR檢測(cè)體系；
　　2)特異性：經(jīng)11株熒光假單胞菌和28株非熒光假單胞菌驗(yàn)證，該體系擴(kuò)增熒光假單胞菌基因組DNA可采集到Ct值＜35的熒光信號(hào)，擴(kuò)增非熒光假單胞菌基因組DNA則無(wú)熒光信號(hào)或Ct值＞35；
　　3)靈敏度：純DNA檢測(cè)靈敏度為14.3 fg/μL(2~3 copies/μL)，純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度為3.0×102 CFU/mL；向25 mL無(wú)菌豆奶樣品中添加2.2 CFU熒光假單胞菌時(shí)，增菌15 h可檢測(cè)到