布魯氏菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、目的：布魯氏菌病作為一種人畜共患病，嚴(yán)重威脅著環(huán)境及人類身體健康，建立一種快速、可靠的布魯氏菌檢測(cè)方法，對(duì)其預(yù)防及診斷都具有重要意義。而熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)是一種公認(rèn)的簡(jiǎn)單、靈敏、快速的檢測(cè)方法。但是，在諸多布魯氏菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的報(bào)道中，人們沒有意識(shí)到抑制物的存在將影響本方法用于樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性及可靠性。因此本文建立了一種含兩種內(nèi)參基因的布魯氏菌熒光定量PCR方法，在快速、靈敏的檢測(cè)布魯氏菌的同時(shí)，質(zhì)控樣品DNA及PCR檢測(cè)

2、過(guò)程，提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性及準(zhǔn)確度。
　　方法：以哺乳動(dòng)物beta-actin基因?yàn)閮?nèi)源性內(nèi)參基因，質(zhì)控樣本DNA；以重組質(zhì)粒為外源性內(nèi)參基因，質(zhì)控PCR擴(kuò)增過(guò)程。針對(duì)布魯氏菌屬特異性基因IS711，建立用于樣品檢測(cè)的布魯氏菌熒光定量PCR方法，優(yōu)化布魯氏菌引物濃度、探針及反應(yīng)溫度，并驗(yàn)證其敏感性、特異性及穩(wěn)定性，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。將該方法用于樣品檢測(cè)，并與細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果比較。之后，將陽(yáng)性樣品進(jìn)行布魯氏菌的SNP基因分型。

3、　　結(jié)果：⑴確立了將哺乳動(dòng)物的beta-actin基因作為內(nèi)源內(nèi)參基因，并設(shè)計(jì)出特異性引物及探針。用于質(zhì)控樣品DNA提取物；選取大西洋鮭魚β-球蛋白基因片段，建立了外源重組質(zhì)粒作為外源性內(nèi)參，用于質(zhì)控PCR擴(kuò)增。⑵建立并優(yōu)化了布魯氏菌熒光定量PCR檢測(cè)方法。⑶建立布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：只擴(kuò)增布魯氏菌DNA時(shí)，相關(guān)系數(shù)R2為0.999(Y=-3.34X+42.85)；擴(kuò)增布魯氏菌和外源重組質(zhì)粒時(shí)，相關(guān)系數(shù) R2為0.997(Y=-

4、3.13X+40.50)；同時(shí)擴(kuò)增布魯氏菌及內(nèi)外源性內(nèi)參基因時(shí)，相關(guān)系數(shù) R2為0.997(Y=-3.12X+40.9)。說(shuō)明加入的外源及內(nèi)源內(nèi)參基因?qū)Σ季鷻z測(cè)沒有太大影響。本檢測(cè)方法的檢測(cè)線達(dá)5.6拷貝·μL-1，在特異性檢測(cè)中，布魯氏菌引物及探針只擴(kuò)增了六種經(jīng)典布魯氏菌，對(duì)陰性參考菌均無(wú)非特異性擴(kuò)增。而且，本檢測(cè)方法穩(wěn)定性良好。⑷將本方法用于樣本檢測(cè)，共檢測(cè)了30份動(dòng)物組織樣品，360份動(dòng)物全血，91份奶樣，其中檢測(cè)出7份布魯氏菌陽(yáng)