番茄褪綠病毒的分子鑒定及熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立與應(yīng)用.pdf

1、番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）作為危害番茄生產(chǎn)的重要病毒。研究快速、高效的識(shí)別及檢測(cè)該病毒的方法，有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒并采取相應(yīng)預(yù)防措施，從而減少其造成的經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過(guò)RT-PCR對(duì)天津市、河北省番茄產(chǎn)區(qū)的番茄及周邊寄主 ToCV發(fā)生情況及 ToCV與番茄黃化曲葉病毒（Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV）復(fù)合侵染情況進(jìn)行檢測(cè)鑒定，并建立了ToCV SYBR G

2、reen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)方法，并對(duì)番茄不同品種、不同發(fā)病時(shí)期及不同發(fā)病部位的病毒含量進(jìn)行了初步定量。
　　主要結(jié)果如下：
　?。?）對(duì)天津市、河北省的番茄產(chǎn)區(qū)采集的319份番茄樣品和55份雜草樣品進(jìn)行ToCV檢測(cè)。其中番茄樣品ToCV檢出率為16.0％，雜草上未檢測(cè)到該病毒。獲得的分離物序列（GenBank登錄號(hào) KP219722/KP226698、KP217199/KP217201、KP217196/KP21

3、7197、KP217195/KP217202、KP217200/KP217198）與中國(guó)、日本和美國(guó)的分離物都聚類在同一個(gè)組上。
　?。?）對(duì)感染ToCV的陽(yáng)性樣品進(jìn)行TYLCV的檢測(cè)，共檢出27份樣品受到ToCV和TYLCV復(fù)合侵染，復(fù)合率為53.0%。
　　（3）根據(jù)GenBank上登錄的ToCV HSP70的基因序列，設(shè)計(jì)了ToCV SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性引物，經(jīng)驗(yàn)證得到了重組質(zhì)粒。以所得質(zhì)

4、粒為模板對(duì)熒光定量 PCR的退火溫度和引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化（退火溫度為63℃，引物濃度為0.2μmol/L）。建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到了相應(yīng)的回歸方程：Ct=-3.227Log（copy number）+49.508。溶解曲線為特異性的單峰，且與瓜類褪綠黃化病毒（Cucurbit chloroticyellows virus，CCYV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、番茄花葉病毒（Tomato masai

5、c virus，ToMV）和番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）均無(wú)交叉反應(yīng)，表明該方法特異性良好。與常規(guī) PCR相比靈敏度高100倍。組間和組內(nèi)變異系數(shù)均小于5.0%，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
　　通過(guò)對(duì)不同部位、不同品種及接種不同時(shí)期番茄病毒含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，莖的韌皮部中含量最高，老葉次之，然后是根部，上部新葉病毒量最低；番茄品種中粉果T03抗病性最差；粉虱接種的番茄植株病毒含量在第28天