轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系的建立.pdf

1、轉(zhuǎn)基因大豆MON8978是美國(guó)孟山都公司研發(fā)的抗草甘膦大豆品種，中國(guó)在2008年批準(zhǔn)其作為加工原料進(jìn)口。本文旨在建立轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系，為轉(zhuǎn)基因大豆MON89788及其制品的安全監(jiān)管提供技術(shù)和理論支持。本研究主要包括以下兩部分:
　　實(shí)驗(yàn)一旨在優(yōu)選出合適的大豆及主要豆制品DNA提取方法，為轉(zhuǎn)基因大豆PCR檢測(cè)中DNA提取方法的比較評(píng)估的提供一套參考體系。實(shí)驗(yàn)以大豆、豆奶粉、豆腐干、大豆蛋白和豆粕為材料

2、，選擇了CTAB法、SDS法和Tiangen離心柱試劑盒法，并根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需要對(duì)其進(jìn)行了改動(dòng)，3種方法提取的DNA通過(guò)紫外分光光度法和實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)DNA質(zhì)量，選出最佳的DNA提取方法。結(jié)果顯示:與SDS法和Tiangen離心柱試劑盒法相比，CTAB法提取的大豆及主要豆制品的DNA質(zhì)量較高，更能夠保證轉(zhuǎn)基因成分PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，并且成本低、操作簡(jiǎn)便。因此，對(duì)于大豆及豆奶粉、豆腐干、大豆蛋白、豆粕等豆制品，CTAB法是3種方法

3、中最合適的DNA提取方法，適用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中DNA模板的制備。
　　實(shí)驗(yàn)二旨在建立一種轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，為轉(zhuǎn)基因大豆MON89788及其制品的快速檢測(cè)提供技術(shù)和理論支持。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建一種新型的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pUC19-LM5，其包含轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性序列和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pUC19-LM5為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品建立轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

4、，并對(duì)建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示:建立的方法高度特異于轉(zhuǎn)基因大豆MON89788檢測(cè);2個(gè)目標(biāo)片段的檢測(cè)極限(LOD)為4拷貝質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA，定量極限(LOQ)為10拷貝質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA;構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)效率大于95％，相關(guān)系數(shù)大于0.99;3個(gè)盲樣的定量分析中，測(cè)量值與設(shè)定值間的偏差(Bias)在-14.81％～9.81％之間，測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.72％～6.28％之間。此外，建立的實(shí)時(shí)熒