沙門菌PCR檢測(cè)方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、沙門菌(Salmonella)是一種重要的食源性病原菌，可引起人和動(dòng)物腸胃炎、傷寒、菌血癥、腸道之外定殖感染(骨髓炎，血管內(nèi)的感染或是病灶性膿腫)、Reiter's綜合癥等多種疾病。人和動(dòng)物常因攝入被沙門菌污染的食物、水，或是與患者接觸而感染。目前許多發(fā)達(dá)國家己建立起完善的監(jiān)測(cè)和控制體系，并對(duì)該菌進(jìn)行了較為深入的研究。本研究的目的是：(1)建立沙門菌PCR檢測(cè)新方法；(2)使用不同類型的樣品評(píng)價(jià)PCR方法；(3)對(duì)本研究獲得的分離株應(yīng)用

2、2007年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦使用的瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行耐藥分析。 一、沙門菌PCR檢測(cè)方法的建立 以沙門菌腸毒素stn基因作為靶基因，建立沙門菌的PCR檢測(cè)方法。對(duì)沙門菌屬A-F群17株沙門菌進(jìn)行特異性檢測(cè)，17株沙門菌經(jīng)PCR擴(kuò)增，在260 bp處分別出現(xiàn)屬特異性條帶，說明該方法無假陰性。對(duì)埃希氏菌屬的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)、腸出血性大腸桿菌EHEC、腸致病性大腸桿菌EPEC、腸侵襲

3、性大腸桿菌ETEC，克雷伯氏菌屬的肺炎克雷伯桿菌，志賀氏菌屬痢疾桿菌、福氏2a志賀氏菌，變形桿菌屬的普通變形桿菌、奇異變形桿菌，檸檬酸桿菌屬的弗氏檸檬酸桿菌，腸桿菌屬的陰溝腸桿菌，普羅威登菌屬的普羅威登斯菌，假單胞菌屬的銅綠假單胞菌，糞鏈球菌，葡萄球菌，蠟樣芽孢桿菌，乳酸桿菌共17種非沙門菌進(jìn)行了特異性檢測(cè)，均無特異性條帶出現(xiàn)。這表明該P(yáng)CR方法具有良好的特異性。該方法可以直接檢出人工污染的樣品，可檢測(cè)到43.85pg沙門菌DNA，增菌

4、后PCR最低檢測(cè)限為ICFU。綜上所述，本研究建立了沙門菌的PCR檢測(cè)方法，該方法具有良好的特異性、敏感性，適合沙門菌的檢測(cè)，為沙門菌監(jiān)測(cè)提供了新方法。 二、PCR方法的初步應(yīng)用 在2008年7月-2009年1月，隨機(jī)采集禽源的肛拭、肝臟病料和雞蛋樣品共1082份，豬源的肛拭、肉類和淋巴結(jié)樣品共466份，揚(yáng)州地區(qū)環(huán)境和游泳池水樣共58份。用PCR方法檢測(cè)這三種來源的樣品，并進(jìn)行沙門菌的分離。結(jié)果顯示：1082份禽源樣

5、品檢出41份陽性，466份豬源樣品檢出15份陽性，58份水源樣品檢出2份陽性，共獲得58株分離株，經(jīng)國標(biāo)方法驗(yàn)證為沙門菌。通過大量樣本驗(yàn)證了本研究建立的PCR方法適用于禽源、豬源、水源樣品的檢測(cè)，而且適用于不同類型的樣品檢測(cè)如：肛拭、肝臟、水樣、肉類樣品等。 三、沙門菌分離株的耐藥性分析 采用2007年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦使用的瓊脂擴(kuò)散法對(duì)100株沙門菌的耐藥性進(jìn)行了研究。 藥敏結(jié)果顯

6、示，沙門菌的耐藥性較高，而且多重耐藥狀況不容樂觀。結(jié)果表明，100株沙門菌對(duì)頭孢類抗生素敏感，但是對(duì)萘啶酸、四環(huán)素和鏈霉素產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性。耐藥譜的分析結(jié)果顯示，100株分離株的多重耐藥主要集中在2耐到5耐和13耐，占78.13％。這些數(shù)據(jù)表明，在我國，沙門菌的多重耐藥的現(xiàn)象十分嚴(yán)重，耐藥譜也比較寬，有4株沙門菌分離株對(duì)13種抗生素同時(shí)產(chǎn)生了耐藥性。本研究中不同樣品來源的分離株對(duì)不同種類抗生素的敏感性存在一定的差異，因此在臨床上應(yīng)用抗