大腸桿菌不耐熱腸毒素的克隆、改造及表達.pdf

1、大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat-labile enterotoxin，LT）是腸產毒性大腸桿（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）分泌的一種熱不穩(wěn)定腸毒素，LT是由一個具有毒性的A亞單位（LTA）和形成環(huán)狀的五個能夠與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結合而粘附于真核細胞膜上的B亞單位（LTB）組成。能引起人和其他哺乳動物的水樣腹瀉。LT除具有毒性外，還能夠有效的啟動局部及全身的體液和細胞免疫，具有很強的粘膜免疫原

2、性和粘膜佐劑活性，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗開發(fā)中具有重要醫(yī)學價值和經(jīng)濟價值。
　　 為制備大量具有免疫活性的LT蛋白，本實驗通過提取產腸毒素大腸桿菌44815菌株的基因組，采用PCR方法分別擴增不耐熱腸毒素A亞基（LTA）和B亞基（LTB）的編碼基因，并將其連接在pMD18-T載體上，構建成LTA和LTB基因的重組載體pMD18-T-LTA和pMD18-T-LTB。陽性克隆篩選采用藍白斑選擇和限制性內切酶XhoⅠ和Nco

3、Ⅰ消化，最后進行序列測定。然后采用定點突變方法將LTA的第63位的絲氨酸改變?yōu)橘嚢彼?，構建成pMD18-T-LTAK63突變體。再分別將pMD18-T-LTAK63和pMD18-T-LTB通過 XhoⅠ和NcoⅠ位點插入到pET-20b(+)原核表達載體，分別構建成LTA和LTB的原核表達載體pET-20b-LTAK63和pET-20b-LTB。將重組LTA和LTB表達載體分別轉化宿主菌Bl21，制備工程菌進行表達。表達產物采用SDS-

4、PAGE方法檢測，目的蛋白分離純化采用鎳瓊脂糖膠粒吸附法。為鑒定帶有人CD5信號肽的LTAK63基因能否在真核細胞中表達，以pMD18-T-LTAK63為模板，通過PCR擴增LTAK63基因，將LTAK63基因連接在pcDNACD5sp真核表達載體上，構建成LTAK63重組質粒pcDNACD5sp-LTAK63。利用磷酸鈣方法將pcDNACD5sp-LTAK63轉染人胚胎腎細胞HEK 293T細胞使其瞬時表達。
　　 本研究構建

5、的重組質粒pMD18-T-LTA和pMD18-T-LTB的測序結果表明：所克隆的LTA基因與GenBank中大腸桿菌標準產毒株LTA基因的大小完全一致，有4個堿基發(fā)生了改變，同源性為99％。在這4個突變中有3個是無義突變，不造成氨基酸的改變，但有1個堿基的突變使谷氨酸變?yōu)橘嚢彼??？梢奓TA基因存在著多態(tài)性；所克隆的LTB基因與GenBank中大腸桿菌標準產毒株LTB基因的完全一致，同源性為100％。利用定點突變方法構建的pMD18-T-

6、LTAK63突變體的測序結果表明LTA的第63位的絲氨酸成功的改變?yōu)橘嚢彼?。構建的原核表達載體經(jīng)XhoⅠ和NcoⅠ雙酶切，得到了符合預期大小的特異性片段，結果證明pET-20b-LTAK63和pET-20b-LTB原核表達載體構建成功。SDS-PAGE檢測宿主菌Bl21表達目的蛋白的結果顯示：在細胞周質中有目的蛋白表達，分別在分子量約為28Kda（LTA)及14Kda（LTB）處有一條明顯的帶。而在細胞的培養(yǎng)基及包涵體中未見目的蛋白表達

7、。同時通過鎳吸附法純化得到了單一目的蛋白。結果表明LTAK63和LTB在Pel信號肽的引導下進行了表達并分泌到細胞周質，而不是以包涵體形式存在，因此表達目的蛋白具有一定的活性，且易于分離純化。在LTAK63基因進行真核表達的基礎上構建的pcDNACD5sp-LTAK63真核表達載體轉染HEK293T細胞，Western blot檢測結果顯示在分子量約為34.8KDa處有一條明顯的雜交帶，而空載體在相應位置未見雜交帶。結果證明pcDNAC