大腸桿菌生物合成中心代謝途徑的改造及其對工程菌色氨酸產(chǎn)量的影響.pdf

1、色氨酸作為必需的氨基酸之一，對于人和動(dòng)物的生長發(fā)育及其新陳代謝都有著重要的意義。廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料添加領(lǐng)域，國內(nèi)國際市場對色氨酸的需求量也在不斷增加。而傳統(tǒng)的化學(xué)合成法和酶法轉(zhuǎn)化等方法的工藝成本又居高不下，這些原因的存在導(dǎo)致我國至今尚未實(shí)現(xiàn)色氨酸生產(chǎn)的工業(yè)化。近年來，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)色氨酸因原料來源十分廣泛易得、適宜大規(guī)模投產(chǎn)而成為研究熱點(diǎn)，因此利用基因工程技術(shù)重新設(shè)計(jì)大腸桿菌代謝系統(tǒng)，構(gòu)建色氨酸工程菌是本實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容。

2、 目的： 改造大腸桿菌色氨酸生物合成的中心代謝途徑，構(gòu)建pZA31-ppsA-tktA重組質(zhì)粒，并與之前構(gòu)建的pZEl2-aroCfbr-trpEDfbr重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化入E.coliMG1655△RT-R菌株，構(gòu)建高產(chǎn)色氨酸菌株；并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵的初步實(shí)驗(yàn)，分別對培養(yǎng)基、裝量、糖濃度變化和pH變化進(jìn)行摸索比較，選取最優(yōu)的培養(yǎng)基和裝量，并得到針對此工程菌科學(xué)的補(bǔ)充碳、氮源的時(shí)間頻率。 方法： 根據(jù)ppsA和tkt

3、A基因序列分別合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增所得PL1acO1-tktA-T1片段和pZA31質(zhì)粒連接，經(jīng)篩選鑒定正確的pZA31-tktA重組質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增所得PL1acO1-ppsA-T1片段連接，構(gòu)建pZA31-ppsA-tktA重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測序鑒定。將鑒定正確的pZA31-ppsA-tktA和pZE12-aroCfbr-trpEDfbr重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至E.coli MG1655△RT-R，獲得的重組菌株命名為E.co

4、liMG1655△RT-R[pZA31-ppsA-tktA/pZE12-aroGfbr-trpEDfrb](工程菌)。對工程菌進(jìn)行發(fā)酵瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。首先根據(jù)工程菌在不同培養(yǎng)基中的生長狀況，確定了適合工程菌發(fā)酵的培養(yǎng)基，然后采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，研究了發(fā)酵瓶裝量，糖濃度以及誘導(dǎo)劑濃度三個(gè)試驗(yàn)因素對工程菌生長以及色氨酸產(chǎn)量的影響。以pZE12-aroGfbr-trpEDfbr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliMG1655△RT-R得到的重組菌株E.c

5、oli MG1655△RT-R[pZE12-aroGfbr-trpEDfbr]作為對照菌株，加入0.5mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，3 hr后收集部分菌體行PpsA、TktA酶活性測定，其余發(fā)酵液繼續(xù)培養(yǎng)4-5 hr后，監(jiān)測調(diào)整培養(yǎng)基中葡萄糖濃度和pH值保持不變，48 hr后檢測色氨酸產(chǎn)量。 結(jié)果： PCR擴(kuò)增所得片段均與預(yù)期DNA表達(dá)片段大小一致；pZA31-ppsA-tktA重組質(zhì)粒測序顯示，

6、克隆的tktA和ppsA基因序列與報(bào)告序列完全相同。工程菌PpsA和TktA酶活性(U)與對照菌株比較，分別提高了3和3.5倍(分別為0.25±0.04 vs.0.08±0.02，P<0.05；0.21±0.03 vs.0.06±0.02，P<0.05)； 確定了適合工程菌發(fā)酵的培養(yǎng)基，工程菌實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵瓶發(fā)酵的最優(yōu)條件為：發(fā)酵瓶裝量為100ml、葡萄糖濃度為1％、誘導(dǎo)劑濃度為0.5mM。色氨酸產(chǎn)量(g/L)與對照菌株比較，提高了

7、1.3倍(1.10±0.05 vs.0.80±0.05，P<0.05)。 結(jié)論： 成功克隆中心代謝途徑上兩個(gè)關(guān)鍵酶基因ppsA和tktA，與對照菌株比較，重組菌酶活分別提高了3和3.5倍。改造了大腸桿菌色氨酸生物合成的中心代謝途徑，使碳源流向中心代謝途徑，為構(gòu)建高產(chǎn)色氨酸基因工程菌，進(jìn)一步提高色氨酸產(chǎn)量打下基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵瓶發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)摸索了最適培養(yǎng)基和優(yōu)化了培養(yǎng)條件，工程菌E.coliMG1655△RT-R[p