重慶地區(qū)兔腹瀉病原菌分離鑒定及檢測方法的建立

1、重慶地區(qū)兔腹瀉病原菌分離鑒定及檢測方法的建立重慶地區(qū)兔腹瀉病原菌分離鑒定及檢測方法的建立許國洋1，沈克飛1，徐登峰1，付利芝1，張素輝1，王孝友1，楊柳1（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶402460）摘要旨在對重慶地區(qū)兔細(xì)菌性腹瀉病原菌進(jìn)行分離鑒定并建立相應(yīng)檢測方法，為該病的檢測及防控奠定基礎(chǔ)。通過臨床診斷與細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)，對引起兔腹瀉的病原菌進(jìn)行分離，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物擴(kuò)增分離菌16SrDNA基因序列，測序分析后，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)

2、化發(fā)育樹。同時(shí)，依據(jù)各病原菌特異性序列設(shè)計(jì)引物，建立PCR檢測方法。結(jié)果表明，共分離到4種病原菌，分子生物學(xué)鑒定后分別確定為：銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌；依據(jù)銅綠假單胞菌外毒素eta基因、產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素基因、金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因和大腸桿菌外膜蛋白eae基因設(shè)計(jì)特異性引物，成功建立多重PCR檢測方法，可從4種病原菌基因組混合物中擴(kuò)增出大小分別為1043、324、200和609bp的目的條帶，對目

3、的菌株最低檢出濃度為103cfumL1。對重慶地區(qū)200份臨床樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)4種病原菌普遍存在，其中，金黃色葡萄球菌單獨(dú)感染檢出率高達(dá)37.6%，金黃色葡萄球菌與大腸桿菌混合感染檢出率達(dá)28%。關(guān)鍵詞兔腹瀉；病原菌；分離鑒定；多重PCR；混合感染，檢出率中圖分類號S852.61文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A收稿日期：20180217修回日期：20180602基金項(xiàng)目：重慶市農(nóng)業(yè)發(fā)展基金（16408）；重慶市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣與服務(wù)補(bǔ)助資金項(xiàng)目（14461

4、）第一作者：許國洋，男，助理研究員，主要從事畜禽疫病防控及分子生物學(xué)研究。Email：guoyangxu@.通訊作者：楊柳，男，副研究員，主要從事畜禽疫病防控及分子生物學(xué)研究。Email：yangliuldz@.近年來，隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)兔業(yè)已成為重慶地區(qū)一項(xiàng)發(fā)展?jié)摿薮蟮漠a(chǎn)業(yè)。但由于重慶地區(qū)的獨(dú)特地理特征和濕熱氣候環(huán)境，為病原菌滋生創(chuàng)造了有利條件，成為疫病多發(fā)的主要誘因之一，嚴(yán)重影響?zhàn)B兔業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。兔腹瀉是一類臨床上表現(xiàn)

5、腹瀉癥狀的疾病，表現(xiàn)為排糞頻繁，糞便稀軟，呈粥樣或水樣便，輕者食欲減退，精神不振，排糞稀軟，呈粥樣或水樣，病兔全身反應(yīng)較輕，虛弱、消瘦、不愛運(yùn)動(dòng)[13]；重者體溫升高，食欲廢絕，精神倦怠，嚴(yán)重腹瀉，呈水樣常混有血液或膠凍樣黏液，糞便惡臭[4]。腹部觸診有明顯痛疼反應(yīng)。呈脫水和衰竭狀態(tài)及自體中毒癥狀，結(jié)膜發(fā)紺，脈博細(xì)弱，呼吸促迫，常因虛脫而死亡[56]。目前，兔腹瀉病在重慶地區(qū)有流行趨勢，多發(fā)于幼兔，給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。兔腹瀉病種類

6、多樣，病因復(fù)雜，其中，由病原菌導(dǎo)致的細(xì)菌性腹瀉最為重要[7]。兔細(xì)菌性腹瀉主要包括：大腸桿菌病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病、泰澤氏菌病、沙門氏菌病、金黃色葡萄球菌病和銅綠假單胞菌病等，其中，以大腸桿菌病和產(chǎn)氣莢膜梭菌病發(fā)生率較高[8]。由于兔細(xì)菌性腹瀉各病原菌致病性與耐藥性差異，導(dǎo)致其在不同地區(qū)呈不同流行趨勢，危害也各有差異，給疫病防控帶來巨大困擾[9]。因此，明確病原，建立有效檢測方法對該病的防控有著重要意義。目前關(guān)于兔細(xì)菌性腹瀉的研究主要是關(guān)于

7、其病原特性和防治措施的，有關(guān)診斷方法的相對較少[10]。傳統(tǒng)病原菌分離鑒定方法費(fèi)時(shí)耗力，成本較高，且易出現(xiàn)漏檢，不能達(dá)到快速診斷的目的。本研究針對重慶地區(qū)兔細(xì)菌性腹瀉病原菌進(jìn)行分離鑒定，并建立檢測方法，為該病的防控奠定理論基礎(chǔ)。1材料與方法1.1試劑細(xì)菌基因組提取試劑盒、2TaqPCRMasterMix、DL2000Marker、膠回收試劑盒和胎牛血清，均購自天根生化科技(北京)有限公司；參照許國洋[11]的方法設(shè)計(jì)細(xì)菌16srDNA的

8、優(yōu)化，上下游引物均以0.1μmolL1為濃度梯度，范圍均為：0.1~0.5μmolL1，退火溫度以2℃為梯度，范圍為：50℃~60℃。2.4多重PCR引物特異性分別提取參考菌株和病原菌株基因組，利用多重PCR最適反應(yīng)條件擴(kuò)增目的基因，進(jìn)行引物特異性分析。2.5多重PCR反應(yīng)靈敏度分析制備108cfumL1各病原菌菌液，10倍梯度稀釋后，提取不同濃度病原菌基因組，選取病原菌濃度范圍為：101~105cfumL1，同一濃度各取2μL作為模板

9、，利用多重PCR最適反應(yīng)條件進(jìn)行靈敏度分析。2.6臨床樣品檢測利用建立的多重PCR反應(yīng)條件對臨床采集的樣本進(jìn)行兔腹瀉病原菌鑒定，并對病原菌多樣性及流行情況進(jìn)行分析。3.結(jié)果與分析3.1臨床癥狀通過對患病兔的臨床診斷，發(fā)現(xiàn)腹瀉病例多為幼兔，腹瀉程度不盡相同（圖1），且多數(shù)病例腸道出血較為嚴(yán)重，腸黏膜出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，見圖2。3.2細(xì)菌分離及分離菌致病性試驗(yàn)利用細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)，共分離到4種疑似病原菌。小鼠攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種12h后，各試驗(yàn)組部

10、分小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、采食和飲水減少、蜷縮不動(dòng)病癥，24h后開始出現(xiàn)死亡，7d后，發(fā)現(xiàn)4種分離菌均可引起小鼠的死亡，死亡率分別為：60%，80%，100%和50%，且從各死亡小鼠的心血和肝臟中均分離到目的菌株。經(jīng)革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)3株為桿狀或短桿菌，1株為球菌，2株為G菌（圖3B、3C），2株為G菌，（圖3A、3D）。A：細(xì)菌分離株1（1000）Bacterialstrain1；B：細(xì)菌分離株2（1000）Bacterialstrain