豬圓環(huán)病毒的分離鑒定及檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（PCV）是近年受到廣泛關(guān)注的危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病源之一。PCV具有PCV1和PCV2兩種基因型。根據(jù)致病性、抗原性、核苷酸序列，將從PK15細(xì)胞系分離的圓環(huán)病毒列為圓環(huán)病毒1型（PCVl），把與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）等密切相關(guān)的圓環(huán)病毒列為2型（PCV2）。本研究主要是從河北保定地區(qū)某豬場(chǎng)疑似PMWS的發(fā)病豬病料中分離到一株病毒，經(jīng)PCR鑒定、生物學(xué)特性的鑒定，進(jìn)而建立快速準(zhǔn)確的臨床診斷方法。
　　

2、無(wú)菌采集疑似PMWS的病豬病料，將其腹股溝淋巴結(jié)接種PK-15細(xì)胞。由于豬圓環(huán)病毒在PK-15細(xì)胞上不產(chǎn)生細(xì)胞病變，接種72h后收毒，盲傳至四代。根據(jù)GenBank上已發(fā)表的PCV2基因序列，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)擴(kuò)增ORF2基因序列的特異性引物，對(duì)細(xì)胞毒提取DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到485bp特異性的核酸片段。
　　 本研究采用過(guò)氧化物酶單層實(shí)驗(yàn)（IPMA）測(cè)定PCV2分離毒的TCID50，并基于此方法對(duì)理化特性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

3、明：該毒株病毒液在PH3和PH12作用1h后TCID50均沒(méi)有顯著變化，毒株表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸堿性；對(duì)胰蛋白酶不敏感；經(jīng)乙醚、氯仿處理后TCID50的差值均小于2，說(shuō)明該病毒沒(méi)有囊膜。試驗(yàn)結(jié)果均符合PCV2生物學(xué)特性。
　　 根據(jù)Genbank上已發(fā)表的豬細(xì)小病毒（PPV）和豬偽狂犬病毒（PRV）的基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增PPV VP2基因片段和PRV UL39基因片段的特異性

4、引物，并建立多重PCR的方法，在同一個(gè)反應(yīng)體系中可同時(shí)擴(kuò)增PCV2、PPV和PRV的特異性片段。通過(guò)對(duì)引物用量、反應(yīng)溫度、模板用量等反應(yīng)條件的優(yōu)化，達(dá)到較為理想的擴(kuò)增效果，并且特異性和重復(fù)性良好。之后對(duì)PCV2的PCR產(chǎn)物用XbaI單酶切，獲得了267bp和228bp的兩個(gè)片段，并構(gòu)建質(zhì)粒pMD18T-PPV和pMD18T-PPV，分別用BamHI和HindIII雙酶切，獲得PPV 158 bp和PRV 219 bp的目的片段，之后通過(guò)

5、序列測(cè)序，分別證實(shí)了擴(kuò)增的條帶的準(zhǔn)確性。
　　 本研究建立了用于檢測(cè)PCV2的雙向乳膠凝集實(shí)驗(yàn)的診斷方法，通過(guò)對(duì)乳膠最佳致敏濃度、最佳致敏溫度和最佳致敏時(shí)間的測(cè)定，確定致敏乳膠的最佳條件，并對(duì)致敏乳膠的穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)，包括保存的溫度和保存時(shí)間的檢查。乳膠凝集抗原質(zhì)量的鑒定包括用PBS、BBS、生理鹽水進(jìn)行的自凝性檢測(cè)和用PRV陽(yáng)性血清、豬瘟陽(yáng)性血清、PCV陰性血清和犢牛血清進(jìn)行的特異性檢測(cè)。結(jié)果表明，本研究所建立的PCV2雙向乳