糖核苷酸的酶法合成與唾液酸糖肽的分離制備.pdf

1、糖類(包括單糖、寡糖和多糖)和糖綴合物廣泛存在于生物體內,作為重要的結構組分和信息分子,在許多生物學過程中都發(fā)揮著重要的作用。糖鏈的結構與其功能有著密切的聯(lián)系,有些糖鏈的改變會引起特定的生理反應,因此,糖鏈的結構與功能研究是糖生物學和生物醫(yī)藥領域的關注熱點。
　　本論文主要分為兩個主要部分:一是合成多種糖核苷酸(第二章和第三章),作為糖基轉移酶合成糖綴合物的糖基供體;二是分離制備唾液酸糖肽,作為內切糖苷酶合成糖綴合物的糖基供體。<

2、br>　　在糖核苷酸的體外合成中,最為簡便的方法是利用補救途徑中的糖激酶和焦磷酸化酶進行合成。單糖首先在糖激酶的催化下合成糖-1-P,再利用焦磷酸化酶合成相應的糖核苷酸。因此,糖-1-P的合成是糖核苷酸合成的第一步。
　　本論文的目標之一是解決酶法合成Gal/Glc-1-P及其結構類似物的問題,進而實現(xiàn)UDP-Gal/Glc及其結構類似物的酶法合成。本文第二章首先對肺炎鏈球菌來源的半乳糖激酶(GalKSpe4)進行了體外的表達及純

3、化,然后選用了34種單糖(包括Gal/Glc及其結構類似物和6種L型糖)與半乳糖激酶進行反應,并對產(chǎn)物和產(chǎn)率進行了檢測。半乳糖激酶具有較寬的底物適應性,它能夠利用34種單糖中的14種作為底物,對于C-2、C-4、C-6位的變化都有較強的適應性,但是其催化活性會隨著C-2位空間位阻的變大而逐漸降低,并且若在半乳糖結構中有兩個位置同時變化,GalKSpe4則無法利用。另外,D型和L型對于GalKSpe4的識別也是十分重要。相比之前報道過的半

4、乳糖激酶,它可以較為高效的合成Glc-1-P(25%)、GalNAc-1-P(68%),同時還具備合成從未報道過的L-Man-1-P(43%)的能力,這也是對半乳糖激酶研究的一個重大發(fā)現(xiàn)。同時,對幾種糖-1-P進行了大量合成,并對其進行了純化和結構鑒定,建立了一套完整的合成-純化-鑒定糖-1-P的制備體系。
　　本文第三章在第二章研究的基礎上,又對大腸桿菌來源的UDP-Glc焦磷酸化酶進行了表達和純化,然后以第二章中半乳糖激酶能夠

5、利用的單糖為底物,利用半乳糖激酶和UDP-Glc焦磷酸化酶,一鍋法合成各種糖核苷酸,并對產(chǎn)物的結構和產(chǎn)率進行了測定。實驗結果表明,在14種單糖中,其中9種單糖可以通過一鍋法直接合成相應的糖核苷酸。對于C-2位發(fā)生結構修飾的Gal結構類似物,只有Gal-2-N3的利用率達到了78%,GalNAc的利用率有32%,而Gal-2-DeO的利用率僅有15%,對于C-2位有較大取代基的Gal的結構類似物,沒有轉化成相應的糖核苷酸。對于C-4位、C

6、-6位發(fā)生結構修飾的Gal結構類似物來說,隨著空間位阻的變大,轉化率有所降低。同時,利用一鍋法大量合成了UDP-Glc并對產(chǎn)物進行了純化和鑒定,建立了一套完整的糖核苷酸制備體系。
　　利用糖苷內切酶的轉糖基活性來合成帶有均一糖鏈的糖蛋白和糖肽是目前較為高效的合成策略,特別是對于一些帶有完整N-糖鏈的糖蛋白的合成。利用這種方法合成帶有完整糖鏈的糖蛋白必須要有完整均一的糖鏈作為糖基供體。唾液酸糖肽是一種帶有完整唾液酸化的N-糖量的糖肽

7、,目前作為糖苷酶切酶的糖基供體己經(jīng)廣泛的用于糖蛋白的合成過程中。
　　本文第四章的目標就是探索一種更為高效簡便、周期短、成本低的唾液酸糖肽的分離制備方法。在本章中,用活性炭柱取代陰陽離子交換柱進行分離純化,取代葡聚糖凝膠G-25進行脫鹽,將原有的七個主要分離純化步驟,簡化為三個,并對分離純化的條件進行了優(yōu)化。通過實驗,從100個雞蛋卵黃中純化出唾液酸糖肽680mg,并其進行了結構鑒定和純度測定,經(jīng)檢測,該唾液酸糖肽的結構與文獻報道