Akkermansia muciniphila源唾液酸糖苷酶基因的克隆表達(dá)與酶學(xué)特性研究.pdf

1、唾液酸又稱為神經(jīng)氨酸，是一類廣泛分布于生物體中的九碳單糖酸。在自然界中，通常以α2，3或α2，6糖苷鍵連接在半乳糖上，α2，6糖苷鍵連接在N-乙酰半乳糖胺上和α2，8糖苷鍵連接在其它唾液酸上。唾液酸糖苷酶是一類能夠識(shí)別并水解糖復(fù)合物非還原末端唾液酸殘基的α外切糖苷水解酶，是糖鏈結(jié)構(gòu)分析中的重要工具酶。
　　Akkermansia muciniphila是一種新發(fā)現(xiàn)的人體腸道益生菌，革蘭氏陰性，嚴(yán)格厭氧，能夠水解粘蛋白上的寡糖鏈來(lái)為

2、其自身的生長(zhǎng)繁殖提供碳源、氮源和能源。Akkermansia muciniphila的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，通過(guò)生物信息學(xué)手段分析發(fā)現(xiàn)，在該菌的全基因組中含有編碼唾液酸糖苷酶基因的序列，而在以前的研究當(dāng)中，亦有關(guān)于該菌能夠表達(dá)唾液酸糖苷酶的報(bào)道。本研究在上述信息基礎(chǔ)上，擬從Akkermansia muciniphila中挖掘新的唾液酸糖苷酶。
　　首先通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，本研究成功的從Akkermansia muciniphila

3、中克隆得到4種唾液酸糖苷酶基因，分別為Am0705、Am0707、Am1757和Am2085，并在β半乳糖糖苷酶基因被敲除的E.coli BL21(DE3)細(xì)胞中進(jìn)行了異源重組表達(dá)，通過(guò)Nickel-NTA一步純化得到單一條帶的蛋白質(zhì)。
　　合適的底物是酶活性檢測(cè)和酶學(xué)特性研究的基礎(chǔ)。為了更好的模擬自然界中唾液酸在復(fù)合物中的存在形式，本研究利用文獻(xiàn)報(bào)道的源自美人魚(yú)發(fā)光桿菌（Photobacterium damsel的唾液酸糖基轉(zhuǎn)移

4、酶PdST6、源自空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）的唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶CjST8、源自腦膜炎奈瑟菌（Neisseriameningitidis）的CMP-Sia合成酶NmCTT和源自發(fā)酵成對(duì)桿菌（Dyadobacterfementans）的唾液酸醛縮酶DfNeuLy，以X-Gal作為唾液酸糖基受體，通過(guò)一鍋多酶法和C18固相萃取柱成功的合成并純化得到8種不同的唾液酸糖苷類化合物，分別為X-Galα2,3 Neu5Ac

5、、X-Galα2,6 Neu5Ac、X-Galα2,3 Neu5Gc、X-Galα2,6Neu5Gc、X-Galα2,3 KDN、X-Galα2,6 KDN、X-Galα2,3 Neu5Prop和X-Galα2,6 Neu5Prop。該唾液酸糖苷類化合物比通常所用的底物如pNP-Sia更接近唾液酸的自然存在形式，因此結(jié)果具有更高的可信度。以X-Galα2，3 Neu5Ac和X-Galα2，6Neu5Ac為底物檢測(cè)重組酶活性，結(jié)果表明，4

6、種重組酶都具有酶活性。
　　以上述合成的8種唾液酸糖苷類化合物作為底物研究4種重組唾液酸糖苷酶的底物特異性，結(jié)果表明，4種重組酶都能夠水解α2，3和α2，6唾液酸糖苷鍵，而且對(duì)X-Galα2，3 Neu5Ac的水解活性最好，然而對(duì)X-Galα2，3KDN和X-Galα2，6KDN的水解能力最弱，因此，以X-Galα2，3 Neu5Ac為底物，進(jìn)一步研究4種重組唾液酸糖苷酶的酶學(xué)特性。研究表明，Am0705、Am0707、Am175

7、7和Am2085的最適pH分別為8.0、6.0、7.5和7.0。最適溫度分別為42℃、42℃、37℃和37℃。Am0705、Am0707、Am1757和Am2085的Km值分別為106μmol/L、80μmol/L、121μmol/L和101μmol/L，Vmax分別為50.6μmol/min、6.6μmol/min、27.5μmol/min和10.4μmol/min。EDTA能夠完全抑制Am0705、Am0707、Am1757和Am2

8、085的活性，然而Am0707卻能夠保持57.9％的活性;Cu2+和Zn2+能夠完全抑制4種酶的酶活性;Fe2+顯著提高Am0705的酶活性至179.9％，然而卻完全抑制Am2085的酶活性;Fe3+顯著提高Am2085的酶活性至145.1％。
　　本研究成功的從人體腸道共生菌Akkermansia muciniphila中克隆得到4種唾液酸糖苷酶同工酶基因。同時(shí)以X-Gal作為唾液酸糖基受體，采用一鍋多酶法成功合成更好模擬唾液酸