酶法合成唾液酸化寡糖及細(xì)菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶WfaN的功能鑒定.pdf

1、唾液酸(sialicacid，Sia)作為一種常見的單糖，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，近年來唾液酸在細(xì)菌尤其是人體病原菌的脂多糖或莢膜多糖中也逐漸被發(fā)現(xiàn)。細(xì)菌中的唾液酸化糖綴合物在細(xì)菌毒力侵襲中發(fā)揮著重要作用，因此參與合成這些結(jié)構(gòu)的酶已成為了治療研究中極具吸引力的靶標(biāo)。
　　 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中唾液酸化的寡糖或糖綴合物無處不在。這種唾液酸化糖鏈不僅參與穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，延長糖蛋白的半衰期，是腦神經(jīng)節(jié)苷脂（參與大腦的發(fā)育過程）的重要組成成分

2、，而且在許多生物學(xué)過程如細(xì)胞識(shí)別，細(xì)胞粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。它們還是某些抗原決定簇的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)組分，在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。唾液酸化糖抗原已經(jīng)成為腫瘤診斷和分期的重要分子標(biāo)記，也有可能用于腫瘤的免疫治療研究中。所以合成這些唾液酸化的寡糖就顯的尤為重要。
　　 唾液酸轉(zhuǎn)移酶(sialyltransferase，ST)是唾液酸化寡糖合成所必須的酶類。相比哺乳動(dòng)物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶，來自細(xì)菌中的唾液酸轉(zhuǎn)移酶更容易在常見

3、的原核生物表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌中過量表達(dá)為可溶的高活性酶，而且某些細(xì)菌來源的ST還表現(xiàn)出廣泛的底物特異性，能夠以帶有化學(xué)修飾基團(tuán)的唾液酸衍生物作為底物，從而豐富了唾液酸化寡糖的種類。
　　 唾液酸化寡糖的酶法合成常常是采用一鍋(one-pot)法，即由糖核苷酸供體CMP-Sia合成的相關(guān)酶類與唾液酸轉(zhuǎn)移酶在一個(gè)反應(yīng)體系中有序的完成多步反應(yīng)，從而免去了CMP-Sia的純化，有效避免了這種不穩(wěn)定化合物的降解，提高了合成效率，縮短了合成

4、時(shí)間。
　　 本論文第二章參考文獻(xiàn)報(bào)道的美人魚發(fā)光桿菌（Photobacteriumdamsela）來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶Pd2，6ST和多巴性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida）來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶PmST1與腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseriameningitidis）來源的NmCSS分別采用一鍋法大量制備了唾液酸化寡糖Neu5Acα2，6lactose和Neu5Acα2，3Gal，這兩類寡糖可以用于許多方面的研究;

5、同時(shí)這也為EscherichiacoliO24來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶WfaN的功能研究奠定了方法基礎(chǔ)。Pd2，6ST是第一個(gè)被克隆的細(xì)菌來源的α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，它對(duì)活化供體CMP-Sia的結(jié)構(gòu)要求比較寬松而且對(duì)受體底物的特異性要求也比較低。PmST1是目前為止所報(bào)道的細(xì)菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶中底物特異性最為寬泛的一個(gè)。論文第二章用常見的原核表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)表達(dá)了Pd2，6ST和PmST1以及NmCSS，并用一鍋法策略大量合

6、成并純化了唾液酸化寡糖。
　　 在P.damsela、P.multocida和嗜血桿菌屬（Haemophilus）等細(xì)菌以及脊椎動(dòng)物中報(bào)道的唾液酸都是通過α2，3或α2，6鍵與半乳糖（galactos，Gal)或乙酰氨基半乳糖(N-acetylgalactosamine，GalNAc)相連，或是通過α2，8鍵與另外一個(gè)唾液酸相連，而在E.coliO24和E.coliO56的O-抗原中存在的唾液酸卻是通過α2，3與葡萄糖(gluc

7、ose，Glc)相連，通過對(duì)兩種細(xì)菌O-抗原合成基因簇進(jìn)行序列比對(duì)，推測參與唾液酸向Glc轉(zhuǎn)移的酶分別是唾液酸轉(zhuǎn)移酶WfaN(E.coliO24中)和WfaR（E.coliO56中）。目前鑒定的ST都是以Gal或其氨基衍生糖或唾液酸為受體的，對(duì)于以Glc為受體的唾液酸轉(zhuǎn)移酶沒有研究報(bào)道。
　　 本論文第三章從E.coliO24的O-抗原合成基因簇中克隆了WfaN的編碼基因，實(shí)現(xiàn)了它們的重組表達(dá)和純化并通過體外反應(yīng)進(jìn)行酶功能驗(yàn)證。