酶法合成唾液酸化寡糖及細菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶WfaN的功能鑒定.pdf

1、唾液酸(sialicacid，Sia)作為一種常見的單糖，廣泛存在于哺乳動物細胞中，近年來唾液酸在細菌尤其是人體病原菌的脂多糖或莢膜多糖中也逐漸被發(fā)現(xiàn)。細菌中的唾液酸化糖綴合物在細菌毒力侵襲中發(fā)揮著重要作用，因此參與合成這些結(jié)構(gòu)的酶已成為了治療研究中極具吸引力的靶標(biāo)。
　　 哺乳動物細胞中唾液酸化的寡糖或糖綴合物無處不在。這種唾液酸化糖鏈不僅參與穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，延長糖蛋白的半衰期，是腦神經(jīng)節(jié)苷脂（參與大腦的發(fā)育過程）的重要組成成分

2、，而且在許多生物學(xué)過程如細胞識別，細胞粘附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。它們還是某些抗原決定簇的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)組分，在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。唾液酸化糖抗原已經(jīng)成為腫瘤診斷和分期的重要分子標(biāo)記，也有可能用于腫瘤的免疫治療研究中。所以合成這些唾液酸化的寡糖就顯的尤為重要。
　　 唾液酸轉(zhuǎn)移酶(sialyltransferase，ST)是唾液酸化寡糖合成所必須的酶類。相比哺乳動物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶，來自細菌中的唾液酸轉(zhuǎn)移酶更容易在常見

3、的原核生物表達系統(tǒng)如大腸桿菌中過量表達為可溶的高活性酶，而且某些細菌來源的ST還表現(xiàn)出廣泛的底物特異性，能夠以帶有化學(xué)修飾基團的唾液酸衍生物作為底物，從而豐富了唾液酸化寡糖的種類。
　　 唾液酸化寡糖的酶法合成常常是采用一鍋(one-pot)法，即由糖核苷酸供體CMP-Sia合成的相關(guān)酶類與唾液酸轉(zhuǎn)移酶在一個反應(yīng)體系中有序的完成多步反應(yīng)，從而免去了CMP-Sia的純化，有效避免了這種不穩(wěn)定化合物的降解，提高了合成效率，縮短了合成

4、時間。
　　 本論文第二章參考文獻報道的美人魚發(fā)光桿菌（Photobacteriumdamsela）來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶Pd2，6ST和多巴性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida）來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶PmST1與腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseriameningitidis）來源的NmCSS分別采用一鍋法大量制備了唾液酸化寡糖Neu5Acα2，6lactose和Neu5Acα2，3Gal，這兩類寡糖可以用于許多方面的研究;

5、同時這也為EscherichiacoliO24來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶WfaN的功能研究奠定了方法基礎(chǔ)。Pd2，6ST是第一個被克隆的細菌來源的α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，它對活化供體CMP-Sia的結(jié)構(gòu)要求比較寬松而且對受體底物的特異性要求也比較低。PmST1是目前為止所報道的細菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶中底物特異性最為寬泛的一個。論文第二章用常見的原核表達宿主E.coliBL21(DE3)表達了Pd2，6ST和PmST1以及NmCSS，并用一鍋法策略大量合

6、成并純化了唾液酸化寡糖。
　　 在P.damsela、P.multocida和嗜血桿菌屬（Haemophilus）等細菌以及脊椎動物中報道的唾液酸都是通過α2，3或α2，6鍵與半乳糖（galactos，Gal)或乙酰氨基半乳糖(N-acetylgalactosamine，GalNAc)相連，或是通過α2，8鍵與另外一個唾液酸相連，而在E.coliO24和E.coliO56的O-抗原中存在的唾液酸卻是通過α2，3與葡萄糖(gluc

7、ose，Glc)相連，通過對兩種細菌O-抗原合成基因簇進行序列比對，推測參與唾液酸向Glc轉(zhuǎn)移的酶分別是唾液酸轉(zhuǎn)移酶WfaN(E.coliO24中)和WfaR（E.coliO56中）。目前鑒定的ST都是以Gal或其氨基衍生糖或唾液酸為受體的，對于以Glc為受體的唾液酸轉(zhuǎn)移酶沒有研究報道。
　　 本論文第三章從E.coliO24的O-抗原合成基因簇中克隆了WfaN的編碼基因，實現(xiàn)了它們的重組表達和純化并通過體外反應(yīng)進行酶功能驗證。