基因突變對細(xì)菌視紫紅質(zhì)功能的影響及相關(guān)功能材料研究.pdf

1、二十一世紀(jì)是生命科學(xué)高速發(fā)展的世紀(jì)。生命科學(xué)不僅自身得到了快速發(fā)展，生命科學(xué)和材料科學(xué)的結(jié)合還有助于增強(qiáng)生命物質(zhì)相關(guān)的特殊功能材料的研發(fā)。細(xì)菌視紫紅質(zhì)(簡稱BR)是一種將光能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能或生理信號的光響應(yīng)蛋白質(zhì)，穩(wěn)定存在于紫膜(PM)當(dāng)中，有望作為一種具備光響應(yīng)特性的功能材料的基本成份。作為視黃醛蛋白質(zhì)家族新成員，古細(xì)菌視紫紅質(zhì)(簡稱AR4)與BR具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。兩者功能上的差異凸顯了結(jié)構(gòu)與功能之間的密切關(guān)系。如何進(jìn)一步闡明其內(nèi)在

2、關(guān)系，又能同時(shí)開展相關(guān)功能材料的基礎(chǔ)研究，是目前視黃醛膜蛋白分子研究的重點(diǎn)之一。
　　 本博士論文以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，從生物和材料交叉學(xué)科的角度入手，通過比較兩種視黃醛蛋白質(zhì)BR和AR4之間的差異，一方面嘗試獲得新的穩(wěn)定基因突變體揭示視黃醛蛋白質(zhì)內(nèi)在的結(jié)構(gòu)與功能的特性，另一方面運(yùn)用突變體蛋白質(zhì)與合成高分子復(fù)合制備光信息存儲膜及蛋白質(zhì)光感受器微陣列的原型材料。此外，還探索了細(xì)菌視紫紅質(zhì)紫膜的新功能。
　　 本論文的主要

3、創(chuàng)造性工作為：
　　 (一)通過比較兩種視黃醛蛋白質(zhì)BR和AR4一級結(jié)構(gòu)的差異，運(yùn)用基因工程定點(diǎn)突變方法，設(shè)計(jì)并獲得包括K41E和D102K等六個(gè)新的BR突變體。通過對突變體性能的研究，排除了第41位賴氨酸和第102位天冬氨酸是決定質(zhì)子提取釋放順序反向的關(guān)鍵氨基酸，并證實(shí)質(zhì)子釋放基團(tuán)(PRC)的pKa值決定質(zhì)子提取釋放的順序。雖然這兩個(gè)帶電荷的殘基并不是BR和AR4中影響質(zhì)子提取釋放順序的關(guān)鍵氨基酸，但是這些突變體確實(shí)對光循環(huán)產(chǎn)

4、生了影響，比如降低了D96的質(zhì)子親和能力以及質(zhì)子從質(zhì)子通道向D96的傳遞速率。此外與野生BR相比，突變體中D102K光循環(huán)中M中間態(tài)和質(zhì)子提取的時(shí)間延長3倍。因此這些殘基可能涉及內(nèi)部質(zhì)子供體對質(zhì)子的提取和釋放。
　　 (二)制備了第96位天冬氨酸被纈氨酸取代的BR突變體D96V及其高分子復(fù)合膜，并進(jìn)行了相關(guān)基礎(chǔ)研究。通過基因工程方法，在本身不表達(dá)BR的嗜鹽菌L33中實(shí)現(xiàn)了新突變體D96V的表達(dá)。具有強(qiáng)疏水性的纈氨酸取代天冬氨酸后

5、，所得突變體蛋白質(zhì)仍然具有光學(xué)響應(yīng)。與野生型BR相比，中性的鹽溶液環(huán)境中突變體D96V的M態(tài)壽命延長近兩個(gè)數(shù)量級，有利于未來作為信息材料使用。將此突變體蛋白質(zhì)與合成高分子聚乙烯醇(PVA)混合后制備得到蛋白質(zhì)/聚合物復(fù)合功能膜，M態(tài)壽命比液體條件下又有顯著的延長。此外，我們還發(fā)現(xiàn)D96V中間態(tài)的壽命對于體系的含水量具有較高的敏感性。
　　 (三)發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)形成的紫膜具有一種新功能--抗細(xì)胞黏附，并進(jìn)一步聯(lián)合生物、化學(xué)和物理的方

6、法制備了具有細(xì)胞黏附反差的視蛋白光感受器微陣列。將小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1、小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞等哺乳動物細(xì)胞接種到紫膜表面培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)紫膜具有強(qiáng)烈的抗拒細(xì)胞黏附的作用。接種細(xì)胞無法在紫膜上黏附、鋪展，并且紫膜對細(xì)胞黏附具有長時(shí)間的抵抗效果。這樣提供了一種嶄新的既有光學(xué)響應(yīng)、又抗污的天然大分子。另一方面，采用基因工程點(diǎn)突變方法引入半胱氨酸取代BR中第36位的天冬氨酸，從而使原本不帶巰基的BR的表面獲得巰基，并與金產(chǎn)生

7、共價(jià)連接，增強(qiáng)了微陣列的穩(wěn)定性和分辨率。利用電沉積法，包含BR和磷脂的紫膜膜片在直流電場中統(tǒng)一取向后附著在金微米陣列上。BR膜一旦靠近金電極，巰基與金即形成共價(jià)鍵。紫膜各層之間則利用偶聯(lián)劑使相鄰層之間形成化學(xué)交聯(lián)，在保證其高度穩(wěn)定性的同時(shí)顯著增強(qiáng)蛋白質(zhì)微陣列的光電信號。物理附著的BR蛋白質(zhì)分子最終被表面活性劑Triton X-100清除，即得到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且單點(diǎn)分布的蛋白質(zhì)微陣列。取向的視蛋白不僅保留了生物活性，光激發(fā)后還能產(chǎn)生累加的電信號