視網(wǎng)膜色素變性TI7M視紫紅質(zhì)突變誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制研究.pdf

1、第一章視紫紅質(zhì)T17M突變體的亞細(xì)胞定位
　　目的:研究視紫紅質(zhì)T17M突變體的亞細(xì)胞定位及意義。
　　方法:構(gòu)建pCDNA-3.1-T17M rhodopsin-myc質(zhì)粒和pCDNA-3.1-WT rhodopsin-myc質(zhì)粒，使用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切法進(jìn)行鑒定，基因測(cè)序。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，采用Western blot檢測(cè)視紫紅質(zhì)T17M突變體和野生型的蛋白表達(dá)差異。免疫熒光顯微鏡下觀察視

2、紫紅質(zhì)T17M突變體和野生型的亞細(xì)胞定位。
　　結(jié)果:經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，獲得約1000bp大小的條帶，基因測(cè)序顯示第50位堿基C突變成T，成功構(gòu)建pCDNA-3.1-T17Mrhodopsin-myc質(zhì)粒和pCDNA-3.1-WT rhodopsin-myc質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，Western blot檢測(cè)到約40KD的條帶，轉(zhuǎn)染可高效表達(dá)視紫紅質(zhì)T17M突變體和野生型蛋白。熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，視紫紅質(zhì)T17突變體聚集在內(nèi)質(zhì)

3、網(wǎng)，與高爾基體不存在共定位;而野生型主要位于細(xì)胞膜。
　　結(jié)論:視紫紅質(zhì)T17M突變體異常定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與高爾基體不存在共定位。視紫紅質(zhì)野生型主要位于細(xì)胞膜。
　　第二章視紫紅質(zhì)T17M突變體的降解途徑
　　目的:研究視紫紅質(zhì)T17M突變體的降解途徑及意義。
　　方法:使用MTT法檢測(cè)視紫紅質(zhì)T17M突變體和野生型的降解速度。Western blot檢測(cè)溶酶體抑制劑CQ和蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)視紫紅質(zhì)T17M

4、突變體和野生型降解的影響。免疫沉淀檢測(cè)視紫紅質(zhì)泛素化水平。Western blot檢測(cè)p97/VCP-QQ和Erasin siRNA對(duì)視紫紅質(zhì)T17M突變體和野生型的半衰期的影響。
　　結(jié)果:蛋白合成抑制劑CHX處理HEK293細(xì)胞和ARPE-19細(xì)胞6h后，CHX處理前視紫紅質(zhì)蛋白標(biāo)化為1，HEK293細(xì)胞的視紫紅質(zhì)T17M突變體和野生型蛋白相對(duì)值分別為0.219±0.032和0.635±0.072(P＜0.01)，ARPE-1

5、9細(xì)胞的視紫紅質(zhì)T17M突變體和野生型蛋白相對(duì)值分別為0.302±0.041和0.531±0.052(P＜0.01)。溶酶體抑制劑CQ處理HEK293細(xì)胞12h后，視紫紅質(zhì)T17M突變體由1增加到1.023±0.265，視紫紅質(zhì)野生型蛋白相對(duì)值由1增加到1.433±0.159(P＜0.05)。蛋白酶體抑制劑MG132處理HEK293細(xì)胞6h后，視紫紅質(zhì)T17M突變體由1增加到7.213±2.108(P＜0.01)，視紫紅質(zhì)野生型蛋白相對(duì)

6、值由1增加到2.011±0.221(P＜0.05)。免疫沉淀后，泛素化視紫紅質(zhì)T17M突變體由1增加到2.200±0.361(P＜0.01)，野生型蛋白相對(duì)值由1增加到1.160±0.162。在ARPE-19細(xì)胞中過(guò)表達(dá)p97/VCP-QQ后，對(duì)照組和p97/VCP-QQ組的視紫紅質(zhì)T17M突變體蛋白相對(duì)值分別為0.159±0.052和0.558±0.095(P＜0.01)。Erasin siRNA處理后，視紫紅質(zhì)T17M突變體的對(duì)照組

7、和Erasin siRNA組的蛋白相對(duì)值分別為0.230±0.059和0.602±0.064(P＜0.01)，而視紫紅質(zhì)野生型降解速度沒有明顯變化。
　　結(jié)論:與視紫紅質(zhì)野生型相比，T17M突變體降解加速。視紫紅質(zhì)T17M突變體只能通過(guò)蛋白酶體系統(tǒng)降解，而野生型可以通過(guò)自噬溶酶體系統(tǒng)和蛋白酶體系統(tǒng)降解。視紫紅質(zhì)T17M突變體的降解與泛素化的ERAD相關(guān)。過(guò)表達(dá)p97/VCP-QQ和Erasin siRNA干擾可以抑制視紫紅質(zhì)T17

8、M突變體通過(guò)ERAD途徑降解。
　　第三章視紫紅質(zhì)T17M突變誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制
　　目的:研究視紫紅質(zhì)T17M突變誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制。
　　方法:建立pEGFP-CL1-ARPE-19細(xì)胞系，采用Western blot方法檢測(cè)其蛋白酶體活性。過(guò)表達(dá)視紫紅質(zhì)蛋白，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，采用Western blot方法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、eIF-2a、active ATF-

9、6a的表達(dá)差異，并用PBA處理細(xì)胞，觀察PBA對(duì)以上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。Tunicamycin處理ARPE-19細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞死亡數(shù)目。過(guò)表達(dá)視紫紅質(zhì)T17M突變體，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，并使用ROS清除劑NAC和BHA處理，觀察細(xì)胞死亡變化情況。
　　結(jié)果:pEGFP-CL1-ARPE-19細(xì)胞系可穩(wěn)定表達(dá)uGFP，視紫紅質(zhì)T17M突變、野生型的uGFP表達(dá)量沒有顯著變化。T17M突變可使細(xì)胞內(nèi)

10、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、eIF-2a、active ATF-6a表達(dá)上調(diào)，與視紫紅質(zhì)野生型相比，BIP、CHOP、GRP94、peIF-2a/eIF-2a、active ATF-6a表達(dá)量分別增加2.439±0.363倍(P＜0.01)、2.433±0.802倍(P＜0.01)、1.600±0.212倍(P＜0.05)、1.567±0.153(P＜0.05)、2.167±0.306倍(P＜0.01)。與

11、視紫紅質(zhì)野生型相比，CHOP表達(dá)量在使用PBA處理前后分別增加了2.600±0.854倍和1.467±0.306倍(P＜0.05)，GRP94表達(dá)量處理前后增加1.921±0.557倍和1.203±0.239倍(P＜0.05)，peIF-2a/eIF-2a為1.733±0.154倍和1.167±0.252倍(P＜0.05)，active ATF-6a為2.564±0.406倍和1.349±0.529倍(P＜0.05)。而使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘

12、導(dǎo)劑Tunicamycin前后，空載體、視紫紅質(zhì)野生型和T17M突變體的ARPE-19細(xì)胞死亡率分別為4.156％±0.501％和4.814％±0.531％、3.879％±0.413％和5.712％±0.574％、7.021％±0.612％和16.213％±3.419％，視紫紅質(zhì)T17M突變體過(guò)表達(dá)的細(xì)胞死亡率較空載體和野生型明顯增加(P＜0.05)。與空載體組相比，視紫紅質(zhì)野生型和視紫紅質(zhì)T17M突變體ROS的相對(duì)比分別為1.136±

13、0.055，1.935±0.088(P＜0.01)。使用ROS清除劑NAC和BHA后，空載體組、DMSO組、NAC組和BHA組的死亡率分別為3.716％±0.523％、7.322％±1.924％、4.857％±1.369％(相比DMSO組，P＜0.05)和4.271％±0.988％(相比DMSO組，P＜0.01)。
　　結(jié)論:視紫紅質(zhì)T17M突變不影響蛋白酶體活性。T17M突變能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白BIP、GRP9