視網膜色素變性TI7M視紫紅質突變誘導細胞死亡的機制研究.pdf

1、第一章視紫紅質T17M突變體的亞細胞定位
　　目的:研究視紫紅質T17M突變體的亞細胞定位及意義。
　　方法:構建pCDNA-3.1-T17M rhodopsin-myc質粒和pCDNA-3.1-WT rhodopsin-myc質粒，使用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切法進行鑒定，基因測序。將構建成功的質粒轉染到HEK293細胞，采用Western blot檢測視紫紅質T17M突變體和野生型的蛋白表達差異。免疫熒光顯微鏡下觀察視

2、紫紅質T17M突變體和野生型的亞細胞定位。
　　結果:經過PCR擴增和雙酶切鑒定，獲得約1000bp大小的條帶，基因測序顯示第50位堿基C突變成T，成功構建pCDNA-3.1-T17Mrhodopsin-myc質粒和pCDNA-3.1-WT rhodopsin-myc質粒。質粒轉染后，Western blot檢測到約40KD的條帶，轉染可高效表達視紫紅質T17M突變體和野生型蛋白。熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，視紫紅質T17突變體聚集在內質

3、網，與高爾基體不存在共定位;而野生型主要位于細胞膜。
　　結論:視紫紅質T17M突變體異常定位于內質網，與高爾基體不存在共定位。視紫紅質野生型主要位于細胞膜。
　　第二章視紫紅質T17M突變體的降解途徑
　　目的:研究視紫紅質T17M突變體的降解途徑及意義。
　　方法:使用MTT法檢測視紫紅質T17M突變體和野生型的降解速度。Western blot檢測溶酶體抑制劑CQ和蛋白酶體抑制劑MG132對視紫紅質T17M

4、突變體和野生型降解的影響。免疫沉淀檢測視紫紅質泛素化水平。Western blot檢測p97/VCP-QQ和Erasin siRNA對視紫紅質T17M突變體和野生型的半衰期的影響。
　　結果:蛋白合成抑制劑CHX處理HEK293細胞和ARPE-19細胞6h后，CHX處理前視紫紅質蛋白標化為1，HEK293細胞的視紫紅質T17M突變體和野生型蛋白相對值分別為0.219±0.032和0.635±0.072(P＜0.01)，ARPE-1

5、9細胞的視紫紅質T17M突變體和野生型蛋白相對值分別為0.302±0.041和0.531±0.052(P＜0.01)。溶酶體抑制劑CQ處理HEK293細胞12h后，視紫紅質T17M突變體由1增加到1.023±0.265，視紫紅質野生型蛋白相對值由1增加到1.433±0.159(P＜0.05)。蛋白酶體抑制劑MG132處理HEK293細胞6h后，視紫紅質T17M突變體由1增加到7.213±2.108(P＜0.01)，視紫紅質野生型蛋白相對

6、值由1增加到2.011±0.221(P＜0.05)。免疫沉淀后，泛素化視紫紅質T17M突變體由1增加到2.200±0.361(P＜0.01)，野生型蛋白相對值由1增加到1.160±0.162。在ARPE-19細胞中過表達p97/VCP-QQ后，對照組和p97/VCP-QQ組的視紫紅質T17M突變體蛋白相對值分別為0.159±0.052和0.558±0.095(P＜0.01)。Erasin siRNA處理后，視紫紅質T17M突變體的對照組

7、和Erasin siRNA組的蛋白相對值分別為0.230±0.059和0.602±0.064(P＜0.01)，而視紫紅質野生型降解速度沒有明顯變化。
　　結論:與視紫紅質野生型相比，T17M突變體降解加速。視紫紅質T17M突變體只能通過蛋白酶體系統(tǒng)降解，而野生型可以通過自噬溶酶體系統(tǒng)和蛋白酶體系統(tǒng)降解。視紫紅質T17M突變體的降解與泛素化的ERAD相關。過表達p97/VCP-QQ和Erasin siRNA干擾可以抑制視紫紅質T17

8、M突變體通過ERAD途徑降解。
　　第三章視紫紅質T17M突變誘導細胞死亡的機制
　　目的:研究視紫紅質T17M突變誘導細胞死亡的機制。
　　方法:建立pEGFP-CL1-ARPE-19細胞系，采用Western blot方法檢測其蛋白酶體活性。過表達視紫紅質蛋白，誘導內質網應激反應，采用Western blot方法檢測內質網應激相關蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、eIF-2a、active ATF-

9、6a的表達差異，并用PBA處理細胞，觀察PBA對以上內質網應激相關蛋白表達的影響。Tunicamycin處理ARPE-19細胞，流式細胞儀檢測細胞死亡數(shù)目。過表達視紫紅質T17M突變體，采用流式細胞儀檢測細胞內ROS水平，并使用ROS清除劑NAC和BHA處理，觀察細胞死亡變化情況。
　　結果:pEGFP-CL1-ARPE-19細胞系可穩(wěn)定表達uGFP，視紫紅質T17M突變、野生型的uGFP表達量沒有顯著變化。T17M突變可使細胞內

10、質網應激蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、eIF-2a、active ATF-6a表達上調，與視紫紅質野生型相比，BIP、CHOP、GRP94、peIF-2a/eIF-2a、active ATF-6a表達量分別增加2.439±0.363倍(P＜0.01)、2.433±0.802倍(P＜0.01)、1.600±0.212倍(P＜0.05)、1.567±0.153(P＜0.05)、2.167±0.306倍(P＜0.01)。與

11、視紫紅質野生型相比，CHOP表達量在使用PBA處理前后分別增加了2.600±0.854倍和1.467±0.306倍(P＜0.05)，GRP94表達量處理前后增加1.921±0.557倍和1.203±0.239倍(P＜0.05)，peIF-2a/eIF-2a為1.733±0.154倍和1.167±0.252倍(P＜0.05)，active ATF-6a為2.564±0.406倍和1.349±0.529倍(P＜0.05)。而使用內質網應激誘

12、導劑Tunicamycin前后，空載體、視紫紅質野生型和T17M突變體的ARPE-19細胞死亡率分別為4.156％±0.501％和4.814％±0.531％、3.879％±0.413％和5.712％±0.574％、7.021％±0.612％和16.213％±3.419％，視紫紅質T17M突變體過表達的細胞死亡率較空載體和野生型明顯增加(P＜0.05)。與空載體組相比，視紫紅質野生型和視紫紅質T17M突變體ROS的相對比分別為1.136±

13、0.055，1.935±0.088(P＜0.01)。使用ROS清除劑NAC和BHA后，空載體組、DMSO組、NAC組和BHA組的死亡率分別為3.716％±0.523％、7.322％±1.924％、4.857％±1.369％(相比DMSO組，P＜0.05)和4.271％±0.988％(相比DMSO組，P＜0.01)。
　　結論:視紫紅質T17M突變不影響蛋白酶體活性。T17M突變能誘導細胞內質網應激，使內質網應激蛋白BIP、GRP9