結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥相關(guān)基因突變檢測(cè)及Rv2629基因191A-C突變功能初步研究.pdf

1、結(jié)核病是人類世界古老的細(xì)菌性傳染病。目前，全世界60億人口中，近1/3(約18億)感染結(jié)核分枝桿菌。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，每年新發(fā)病人達(dá)800～1000萬(wàn)，每年因結(jié)核病死亡者達(dá)200余萬(wàn)，98％的結(jié)核病死亡發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。作為有著巨大人口壓力的發(fā)展中國(guó)家，中國(guó)的結(jié)核病負(fù)擔(dān)也相當(dāng)嚴(yán)重。 近三十年來(lái)，結(jié)核分枝桿菌與HIV的共感染，以及多耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)改變了結(jié)核的流行病學(xué)模式，尤其是近期在非洲大陸發(fā)現(xiàn)極端耐藥結(jié)核分枝桿菌，該類病原

2、菌耐受包括利福平、異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和鏈霉素等在內(nèi)的所有一線藥，并表現(xiàn)出對(duì)6種二線治療藥物中的至少3種耐藥。到目前為止，極端耐藥性結(jié)核分枝桿菌已在全球包括8個(gè)歐洲國(guó)家在內(nèi)的28個(gè)國(guó)家傳播，而極端耐藥性結(jié)核患者數(shù)量約為2.7萬(wàn)例，因此而死亡的患者數(shù)已逾1.6萬(wàn)例。這些數(shù)據(jù)使得全部極端耐藥性結(jié)核感染患者的死亡率超過(guò)了50％，甚至在某種程度上高過(guò)了艾滋病感染的致死率。另?yè)?jù)一項(xiàng)調(diào)查表明，艾滋病患者更容易受到“極端耐藥結(jié)核菌”的感染而死亡

3、。目前所有可用的抗結(jié)核藥物都無(wú)法治療這種結(jié)核病，一旦傳播開(kāi)來(lái)，人類將面臨重大災(zāi)難。研究結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制，對(duì)開(kāi)發(fā)新型藥靶，研制快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法意義重大。 利福平是治療結(jié)核病的重要一線藥物，超過(guò)95％的利福平抗性的產(chǎn)生是由于編碼RNA聚合酶β-亞單位基因中(rpoB)81對(duì)堿基突變?cè)斐桑?％～10％的利福平耐藥菌株的rpoB基因未檢測(cè)到突變，說(shuō)明結(jié)核分枝桿菌存在其它的利福平抗性機(jī)制。90％以上耐利福平菌株也抗異煙肼，所以

4、利福平抗性也是多耐藥結(jié)核的一個(gè)潛在標(biāo)志。 為了檢測(cè)利福平耐藥株中的耐藥因子，我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)手段，對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv和臨床耐藥菌株的菌體蛋白進(jìn)行比較分析，對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定，繼而對(duì)蛋白的編碼基因克隆測(cè)序。一共有9個(gè)差異蛋白被鑒定出來(lái)，它們是Rv0054、Rv0927c、Rv1446c、Rv2145c、Rv2629、Rv2334、Rv3J33c、Rv3136和Rv3841。通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物PC

5、R擴(kuò)增18株臨床利福平耐藥菌株、15株藥物敏感菌株和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的對(duì)應(yīng)片段，進(jìn)行DNA測(cè)序。結(jié)果顯示：Rv0054、Rv3133c、Rv2145、Rv3136c和Rv2334等5個(gè)基因的核苷酸序列在所有菌株中沒(méi)有發(fā)生突變。Rv0927c基因402—422位堿基的GCA缺失，導(dǎo)致編碼的140位絲氨酸(SER)缺失；Rv1446c基因575位堿基的GMP殘基突變?yōu)镃MP，導(dǎo)致編碼的氨基酸由精氨酸(ARG)突變?yōu)楦彼?PRO)；R

6、v3841基因468位堿基的AMP殘基突變?yōu)镚MP，但編碼的156位氨基酸仍然保持為亮氨酸(LEU)。這些基因突變位點(diǎn)同利福平耐藥的關(guān)聯(lián)度不高，可能是菌株地域多態(tài)性在基因水平的顯示，可以作為流行病調(diào)查時(shí)參考的分子指標(biāo)。而Rv2629基因中發(fā)現(xiàn)了191 A/C突變，導(dǎo)致64ASP變?yōu)?4ALA。這種突變存在于112株臨床利福平耐藥菌株中的111株，突變率達(dá)99.1％;然而在30株臨床藥物敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)。進(jìn)一步將Rv2629基因的野生型和

7、突變型轉(zhuǎn)入利福平敏感的恥垢分枝桿菌，藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rv2629基因在191位點(diǎn)的突變可以增強(qiáng)受體菌的耐藥性，而野生型基因不能賦予重組菌株藥物耐受性。同時(shí)對(duì)該蛋白進(jìn)行了體外表達(dá)，通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定了野生型重組蛋白和突變蛋白的分子量分別為46268.4Da和46231.5Da。利用制備的兔源多抗血清，對(duì)該蛋白在H37Rv菌體的分布進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，Western Blot結(jié)果顯示蛋白主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。對(duì)不同菌株中基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行