釀酒酵母YS2-△adh2-△ald6突變株的構(gòu)建及hxt1基因的過表達(dá).pdf

1、生物質(zhì)能源是化石能源良好的替代品，乙醇作為比較理想的可再生液體燃料備受國內(nèi)外科學(xué)家的親睞。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為傳統(tǒng)乙醇生產(chǎn)主要用菌，選育其高產(chǎn)菌株一直是燃料乙醇生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。其中，應(yīng)用重組DNA和分子改造技術(shù)有目的地改變酵母表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和已有代謝途徑，優(yōu)化細(xì)胞代謝機(jī)制，構(gòu)建優(yōu)良性狀工業(yè)微生物顯得尤為重要。 本研究依據(jù)釀酒酵母本身高效的同源重組機(jī)制，應(yīng)用過表達(dá)和基因敲除技術(shù)，增強(qiáng)合成底

2、物代謝利用率，降低或阻遏乙醇分解代謝流，成功構(gòu)建雙基因缺失突變菌株YS2-△aadh2-△ald6和過表達(dá)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因hxt1的YS2-△adh2-△ald6-hxt1突變株。取得以下研究進(jìn)展： 1、以adh2基因缺陷型釀酒酵母YS2一△adh2為出發(fā)菌株，應(yīng)用長(zhǎng)側(cè)翼同源兩步PCR(LFH-PCR)策略構(gòu)建ald6基因敲除組件，轉(zhuǎn)化釀酒酵母YS2-△adh2進(jìn)行同源重組，之后轉(zhuǎn)入表達(dá)質(zhì)粒pSH65到陽性克隆中，半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)

3、Cre重組酶切除Kanr基因篩選標(biāo)記，最后，傳代丟失質(zhì)粒pSH65獲得雙倍體ald6基因缺失突變株YS2-△adh2-△ald6。發(fā)酵試驗(yàn)表明與出發(fā)菌株YS2相比，突變株乙酸合成量降低18％，乙醇最高產(chǎn)量提高12.5％。生理特性試驗(yàn)表現(xiàn)為突變株具有很高的遺傳穩(wěn)定性，生長(zhǎng)情況不受影響。 2、在pSH47質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計(jì)分別帶有EcoR I酶切位點(diǎn)引物將hxt1 ORF與截短的hxt7啟動(dòng)子融合到CYC1終止子的上游區(qū)域。隨后

4、將pUG6載體上的Kanr抗性基因片段連接到pSHG17載體上，構(gòu)建了整合表達(dá)載體pSHGK17。轉(zhuǎn)化酵母突變株YS2-△adh2-△Aald6，經(jīng)G418抗性篩選、PCR驗(yàn)證得到過表達(dá)hxt1基因突變株YS2-△adh2-△ald6-hxt1。生長(zhǎng)方面突變株遲滯期稍長(zhǎng)，指數(shù)生長(zhǎng)中后期菌濃上升較快，其他方面沒有顯著差異，遺傳穩(wěn)定性高。發(fā)酵檢測(cè)，突變株YS2-△adh2-△ald6-hxt1與YS2-△adh2-△adh6和YS2菌株相比

5、，糖代謝加快，發(fā)酵周期分別提前了3小時(shí)和8小時(shí)；乙醇產(chǎn)量較YS2菌株提高了12.65％。 在化石能源儲(chǔ)量日趨減少，環(huán)境污染問題日益加劇，能源需求和石油價(jià)格持續(xù)上漲的背景下，世界各國都在積極開發(fā)利用可再生的綠色清潔能源。燃料乙醇以其污染小、經(jīng)濟(jì)可行、原料來源廣泛等特點(diǎn)作為目前大規(guī)模替代石油的可再生能源，受到國內(nèi)外普遍關(guān)注。在我國，開發(fā)利用新能源和可再生能源，已成為調(diào)整和優(yōu)化能源結(jié)構(gòu)、解決環(huán)境污染問題的國家戰(zhàn)略。目前，燃料乙醇研究可

6、分為三大類：菌種選育研究、發(fā)酵工藝研究、特殊需要的基因工程菌構(gòu)建。 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)做為傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌株，具有乙醇耐受性強(qiáng)，發(fā)酵工藝成熟，工業(yè)應(yīng)用范圍廣泛，與其它微生物比較生物安全性好等特點(diǎn)。同時(shí)，釀酒酵母是第一個(gè)基因組完成測(cè)序的真核生物，遺傳背景非常清楚，由于其體內(nèi)具有高效的同源重組機(jī)制，在分子和基因水平進(jìn)行操作非常容易。在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，為了降低發(fā)酵工藝成本、實(shí)現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)

7、出率，菌種的優(yōu)劣在整個(gè)生產(chǎn)流程中尤為重要。因此，菌種的選育必須以降低生產(chǎn)耗資與高產(chǎn)出為原則。近年來，依據(jù)代謝工程理念，應(yīng)用分子生物學(xué)手段對(duì)釀酒酵母進(jìn)行分子育種是主要的研究方向，其中，尤為突出的是重組DNA技術(shù)。應(yīng)用代謝工程理念使用基因工程手段對(duì)菌種改造過程中，敲除或過表達(dá)特定基因可以闡明該基因功能，改變代謝途徑，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。同時(shí)，該突變株為進(jìn)一步探索目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制、基因與蛋白質(zhì)相互作用以及分子信號(hào)傳導(dǎo)通路等提供了理想材

8、料，并為進(jìn)一步從基因和分子水平改進(jìn)釀酒酵母乙醇代謝途徑，構(gòu)建優(yōu)良性狀高產(chǎn)乙醇生產(chǎn)菌奠定了基礎(chǔ)。本研究利用釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的同源重組機(jī)制，運(yùn)用基因敲除和過表達(dá)技術(shù)，降低了由乙醛生成乙酸的分解代謝流，并在此基礎(chǔ)上增強(qiáng)了己糖代謝率。與原始出發(fā)菌株相比，不僅提高了乙醇產(chǎn)量，而且縮短了發(fā)酵周期，提高了發(fā)酵產(chǎn)率。研究?jī)?nèi)容如下： (1)釀酒酵母主要有五個(gè)編碼乙醇脫氫酶基因：adh1、adh2、adh3、adh4、adh5，其中Adh1p、Adh

9、3p、Adh4p和Adh5p五個(gè)乙醇脫氫酶在代謝中執(zhí)行還原乙醛生成乙醇功能，而乙醇脫氫酶Adh2p其生物學(xué)功能卻催化乙醇生成乙醛。本工程中心利用基因敲除技術(shù)成功構(gòu)建了adh2基因缺陷型突變株，該菌株在發(fā)酵后期乙醇合成代謝穩(wěn)定，乙醇分解利用率低于出發(fā)菌株。乙醛脫氫酶VI(ald6)是乙醛脫氫酶家族ACDH的一種，其基因編碼乙醛脫氫酶Ald6p，執(zhí)行生物催化乙醛至乙酸的生物學(xué)功能，是糖酵解過程中乙酸發(fā)酵的關(guān)鍵酶。在釀酒酵母adh2基因缺失基

10、礎(chǔ)上敲除ald6基因，有望降低乙醛至乙酸分解代謝流，從而使更多的乙醛轉(zhuǎn)化生成乙醇。 本研究采用長(zhǎng)側(cè)翼同源兩步PCR(LFH-PCR)方法構(gòu)建ald6基因敲除組件。首先設(shè)計(jì)引物合成目的基因的上下游同源片段和pUG6質(zhì)粒上面帶有Kanr基因篩選標(biāo)記的兩個(gè)loxP位點(diǎn)片段。擴(kuò)增ald6基因上游同源片段反向引物的5'端序列與擴(kuò)增篩選標(biāo)記正向引物序列是反向互補(bǔ)的，同樣，擴(kuò)增ald6基因下游同源片段正向引物的5'端序列與擴(kuò)增篩選標(biāo)記反向引物

11、序列是反向互補(bǔ)的。隨后將擴(kuò)增得到的三個(gè)片段運(yùn)用重疊延伸PCR合成帶有Kanr篩選標(biāo)記的基因敲除組件。采用醋酸鋰高效率轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母adh2基因缺陷型菌株YS2-△adh2，與ald6基因序列發(fā)生同源重組，用G418抗性篩選克隆子，采用PCR驗(yàn)證得到陽性克隆子。隨后轉(zhuǎn)化帶有腐草霉素篩選標(biāo)記的pSH65質(zhì)粒到陽性克隆中，半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)Cre重組酶，切除兩個(gè)loxP位點(diǎn)片段中間的Kanr篩選標(biāo)記基因序列，最后在原來目的基因位點(diǎn)處只留下一

12、個(gè)loxP位點(diǎn)。采用相同的技術(shù)和步驟敲除ald6的等位基因，最終獲得雙基因缺陷型菌株YS2-△adh2-△ald6。 原始菌株YS2、單基因缺失菌株YS2-△adh2和雙基因缺陷型菌株YS2-△adh2-Aald6相比，雙基因的缺失對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有影響，細(xì)胞形態(tài)相似，而且遺傳穩(wěn)定性高。發(fā)酵檢測(cè)突變株YS2-△adh2-△ald6乙醇合成量比YS2-△adh2提高了6.9％，比YS2提高12.5％，且乙酸產(chǎn)量較YS2降低了18％。Y

13、S2-△adh2-△ald6突變株的生物學(xué)效應(yīng)說明了adh2和ald6基因在乙醇的合成代謝過程中起著一定的調(diào)節(jié)作用。 本研究設(shè)計(jì)了長(zhǎng)側(cè)翼同源PCR(LFH-PCR)結(jié)合Crc/loxP系統(tǒng)敲除了ald6基因，這種方法可以得到幾百bp左右側(cè)翼同源區(qū)域，大大提高了同源重組效率，縮減了篩選工作量。本研究采用的技術(shù)和方法為其他物種的長(zhǎng)側(cè)翼同源基因敲除提供了參考。利用Cre/loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的標(biāo)記挽救可以在同一菌株連續(xù)多次使用相同的抗性標(biāo)

14、記，有效解決了野生型工業(yè)酵母多基因敲除時(shí)篩選標(biāo)記有限的難題。 (2)由于酵母本身不具備完善的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，在釀酒工業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常出現(xiàn)緩慢和不完全的乙醇發(fā)酵現(xiàn)象。葡萄糖在己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下進(jìn)行跨膜運(yùn)輸是釀酒酵母發(fā)酵代謝的控制點(diǎn)。在釀酒酵母細(xì)胞中，己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(HXT)包括20多個(gè)具有不同葡萄糖親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。如果細(xì)胞中缺少這些己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，葡萄糖的消耗和運(yùn)輸幾乎完全終止。Hxt1-hxt4，還有hxt6、hxt7是主要的葡萄

15、糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因。高濃度葡萄糖會(huì)抑制編碼高親和力和中等親和力的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)，同時(shí)，低親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因被誘導(dǎo)表達(dá)。Hxt1p作為最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一，在高濃度葡萄糖介質(zhì)中(>1％w/v)被誘導(dǎo)表達(dá)。5'端缺失只留有編碼區(qū)ATG上游390 bp的hxt7啟動(dòng)子序列具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，在乙醇和葡萄糖介質(zhì)中可以形成組成型表達(dá)。在本研究當(dāng)中，通過構(gòu)建整合表達(dá)載體pSHGK17將hxt1 ORF與截短的hxt7啟動(dòng)子融合，轉(zhuǎn)化釀酒酵母adh2

16、，ald6雙基因缺失突變株YS2-△adh2-△ald6進(jìn)行同源重組，增強(qiáng)Hxt1p的表達(dá)量。 首先設(shè)計(jì)分別帶有EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增hxt1基因，然后連接到經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后的pSH47載體上，且將hxt1基因置于CYC1終止子的上游，構(gòu)建載體命名為pSHG1。隨后用分別帶有Sac I和EcoR I酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增hxt7啟動(dòng)子序列，連接到經(jīng)Sac I和EcoR I雙酶切的pSHG1載體上

17、，構(gòu)建載體命名為pSHG17。為了增加轉(zhuǎn)化酵母后的抗性篩選標(biāo)記，用PvuII和EcoR V雙酶切pUG6載體上的Kanr篩選標(biāo)記片段，連接到經(jīng)EcoR V單酶切的pSHG17載體上，構(gòu)建整合表達(dá)載體為pSHGK17。最后用EcoR V單酶切pSHGK17載體，轉(zhuǎn)化釀酒酵母YS2-△adh2-△ald6進(jìn)行同源重組，用G418篩選克隆子。然后用PCR驗(yàn)證得到陽性克隆子，構(gòu)建釀酒酵母突變株命名為YS2-△adh2-△ald6-hxt1。

18、 在生長(zhǎng)方面，過表達(dá)hxt1突變株YS2-△adh2-△ald6-hxt1遲滯期略長(zhǎng)，在指數(shù)生長(zhǎng)中后期生物量增長(zhǎng)較快，具有很高的遺傳穩(wěn)定性。通過發(fā)酵檢測(cè)，過表達(dá)hxt1突變株YS2-△adh2-△ald6-hxt1與雙基因缺陷型菌株YS2-△adh2-△Aald6和原始出發(fā)菌株YS2相比，耗糖快，發(fā)酵周期分別提前了3小時(shí)和8小時(shí)，乙醇產(chǎn)量較YS2提高了12.65％。構(gòu)建成功的突變株YS2-△adh2-△ald6-hxt1是一株具有潛