釀酒酵母MF1015菌株adh2和ald6基因的敲除研究.pdf

1、乙醇作為一種重要的基礎(chǔ)工業(yè)原料,被廣泛用于食品、化工、醫(yī)藥、軍工等眾多行業(yè)。通過基因工程改造、構(gòu)建釀酒酵母乙醇發(fā)酵生產(chǎn)菌種,以提高該產(chǎn)業(yè)的乙醇發(fā)酵水平,可顯著降低其生產(chǎn)能耗和原材料單耗,降低勞動(dòng)成本,具有極為顯著的經(jīng)濟(jì)效益,并可同時(shí)探討釀酒酵母乙醇發(fā)酵這一最基本的生命現(xiàn)象的規(guī)律,具有極其重要的應(yīng)用與理論意義,一直是微生物學(xué)、分子生物學(xué)以及乙醇發(fā)酵工業(yè)等學(xué)科領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
　　adh2和ald6二基因分別編碼乙醇脫氫酶和乙醛

2、脫氫酶,參與釀酒酵母的乙醇發(fā)酵代謝。其中,前者調(diào)控催化乙醇生成乙醛的過程,后者調(diào)控乙醛氧化為乙酸的過程。本文根據(jù)代謝工程原理,以甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵高產(chǎn)菌株 MF1015為出發(fā)菌株,通過建立穩(wěn)定的單倍體細(xì)胞系,利用同源重組原理敲除這二個(gè)基因,再進(jìn)行菌株核型復(fù)倍,成功構(gòu)建了雙倍體突變菌株MF1015-Δadh2-Δald6。
　　研究結(jié)果如下:以MF1015為出發(fā)菌株,構(gòu)建該菌株的a型和α型單倍體。構(gòu)建adh2和ald6基因敲除組件,并

3、分別轉(zhuǎn)化到a型和α型單倍體中。篩選得到陽(yáng)性克隆子后轉(zhuǎn)入pSH65表達(dá)質(zhì)粒,半乳糖誘導(dǎo)消除抗性基因,pSH65表達(dá)質(zhì)粒后經(jīng)傳代遺失。將a型和α型的目的單倍體菌株混于YEPD培養(yǎng)基中使其自然交配復(fù)倍,最終篩選得到突變菌株MF1015-Δadh2-Δald6。蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)顯示,該突變菌株與原出發(fā)菌株 MF1015相比,乙醇產(chǎn)量提高8.59％,乙酸產(chǎn)量降低9.75%;糖蜜補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)顯示,該菌株與原出發(fā)菌株MF1015相比,乙醇產(chǎn)量提高5.39