釀酒酵母skpl和rav2基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、V-ATP酶(vacuolar ATPase)又稱液泡ATP酶,是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中靠水解ATP產(chǎn)生的能量來(lái)轉(zhuǎn)移質(zhì)子從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外pH值的一種ATP酶。V-ATP酶在環(huán)境中的葡萄糖濃度降低時(shí)可以可逆分解為V0和V1兩部分來(lái)調(diào)節(jié)酶的活性。RAVE(regulator of the H+-ATPase of the vacuolar and endosomal membranes)復(fù)合物在V-ATP酶此種活性調(diào)節(jié)方式中起到

2、重要作用。RAVE復(fù)合物由Skp1p、Rav1p和Rav2p三個(gè)亞基組成。目前有關(guān)RAVE結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及RAVE對(duì)V-ATP酶活性調(diào)節(jié)機(jī)理的研究很少。
　　 根據(jù)NCBI報(bào)道的來(lái)源于釀酒酵母的skpl基因序列和表達(dá)載體pET-21c設(shè)計(jì)引物,然后以釀酒酵母BY4742的基因組DNA為模板擴(kuò)增skpl。將純化后的PCR產(chǎn)物直接用NdeⅠ和NotⅠ雙酶切,然后與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-21c連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-21cS1。

3、經(jīng)PCR和雙酶切驗(yàn)證后的質(zhì)粒再經(jīng)DNA測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證,克隆的基因完全正確。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)1mmol/L的IPTG,25℃誘導(dǎo)4h,表達(dá)出Skp1p。誘導(dǎo)后的大腸桿菌經(jīng)超聲細(xì)胞破碎,再經(jīng)Ni-NTA凝膠純化得到可溶的目的蛋白。
　　 以釀酒酵母BY4742的基因組DNA為模板擴(kuò)增ray2。將純化后的rav2與pUCm-T載體相連構(gòu)建重組質(zhì)粒命名為pUCTR2。將質(zhì)粒pUCTR2用NdeⅠ和NotⅠ雙

4、酶切,然后膠回收ray2,并將其與經(jīng)過(guò)同樣酶切的表達(dá)載體pET-21c相連構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-21cR2。經(jīng)PCR和雙酶切驗(yàn)證后的質(zhì)粒再經(jīng)DNA測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證,克隆的基因完全正確。將重組質(zhì)粒pET-21cR2轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。重組菌在1mmol/L IPTG,25℃,150r/min的誘導(dǎo)條件下表達(dá)出目的蛋白R(shí)av2p,但大部分為包涵體。經(jīng)過(guò)表達(dá)條件的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在LB培養(yǎng)基中添加0.5％的葡萄糖并在0.5mmol/L的IP

5、TG,16℃,80r/min條件下誘導(dǎo)10h可得到更多可溶的Rav2p。誘導(dǎo)后的大腸桿菌經(jīng)超聲破碎,再經(jīng)Ni-NTA凝膠純化得到可溶的樣品。
　　 根據(jù)SOPMA的預(yù)測(cè),釀酒酵母的Rav2p中含有46.72％的α螺旋,17.66％的β折疊,4.84％的β轉(zhuǎn)角和30.77％的無(wú)規(guī)則卷曲。在NCBI中BLAST的結(jié)果顯示:釀酒酵母的Rav2p與Zygosaccharomyces rouxii中的ZYROOC04554p同源性為49％

6、;與Vanderwaltozyma polyspora中的Kpol_1064p58同源性為49％;與Ashbya gossypii中的AGL104Cp的同源性為45％。釀酒酵母Rav2p氨基酸序列的保守區(qū)分析顯示,Rav2p屬于Rogdi-lz家族中功能未知的一種蛋白。Rav2p中含有20個(gè)含硫氨基酸和13個(gè)脯氨酸,這種氨基酸組成可能是造成其在大腸桿菌中易形成包涵體的重要原因。
　　 以構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-21cR2為模板擴(kuò)

7、增ray2。將純化后的rav2與共表達(dá)載體pETDuet-1經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuet-R2。經(jīng)PCR與雙酶切驗(yàn)證,選擇正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)@,經(jīng)1mmol/L的IPTG,25℃誘導(dǎo)2h后表達(dá)Rav2p。以構(gòu)建好的pET-21cS1為模板擴(kuò)增skp1。將純化后的skp1直接用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,然后與經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒pETDuet-R2相連構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet

8、-R2S1。將共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-R2S1經(jīng)PCR與雙酶切驗(yàn)證后再經(jīng)DNA測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證,證明skp1與rav2均克隆正確。含共表達(dá)質(zhì)粒的BL21(DE3)在終濃度為1mmol/L的IPTG,25℃,150r/min的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)6h,SDS-PAGE顯示沒有出現(xiàn)目的蛋白條帶。誘導(dǎo)條件改為1mmol/L的IPTG,37℃,150r/min后,誘導(dǎo)2h時(shí),表達(dá)出Skp1p但是沒有表達(dá)出Rav2p,誘導(dǎo)4h時(shí),表達(dá)出Skplp和Ra