培養(yǎng)基添加劑對重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)重組α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響.pdf

1、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡稱CGT酶，EC2.4.1.19)是一種能夠通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)轉(zhuǎn)化淀粉及相關(guān)基質(zhì)合成環(huán)糊精的胞外酶。隨著環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣，CGT酶已經(jīng)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。為了克服天然菌株的低CGT酶生產(chǎn)能力，CGT酶基因在大腸桿菌(Escherichia coli)中過量表達(dá)被認(rèn)為是最有效途徑之一。然而，以前的報道表明，CGT酶在E.coli中表達(dá)通常形成不溶性包涵體或定位于周質(zhì)空間，限制了其工業(yè)應(yīng)用，

2、因此，實(shí)現(xiàn)CGT酶的胞外表達(dá)是迫切需要的。本文以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含表達(dá)載體cgt/pET20b(+)的E.coli BL21(DE3)為生產(chǎn)菌株，以實(shí)現(xiàn)重組α-CGT酶的高產(chǎn)量及高生產(chǎn)強(qiáng)度為目標(biāo)，對在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量添加劑對胞外基質(zhì)中的產(chǎn)酶情況進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，并進(jìn)一步對其機(jī)理進(jìn)行了剖析。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中，考察了表面活性劑的添加對重組E.coli胞外生產(chǎn)α-CGT酶的影響。研究結(jié)果表明，在發(fā)酵

3、培養(yǎng)基中添加表面活性劑對重組E.coli的生長都有一定的抑制，而且添加濃度越大，抑制作用越強(qiáng)。其中CTAB對菌體生長的抑制作用最大；Tween-80對菌體生長的抑制作用最小。表面活性劑的添加對重組E.coli胞外生產(chǎn)α-CGT酶有促進(jìn)作用，其中在發(fā)酵20 h添加0.02% SDS效果最好，發(fā)酵40 h胞外α-CGT酶酶活達(dá)5.31 U/mL，比對照組提高了5.25倍。
　　 (2)在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中，考察了金屬離子的添加對重組E

4、coli包外生產(chǎn)α-CGT酶的影響。研究結(jié)果表明，只有在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加Ca2+才對重組E.coli胞外生產(chǎn)α-CGT酶有促進(jìn)作用，當(dāng)其添加濃度為2.5 mM時，胞外α-CGT酶酶活達(dá)1.12 U/mL，是對照組的1.3倍。Ca2+對胞外酶活的提高除了與細(xì)胞膜透性有關(guān)，還可能與其對細(xì)胞生長的輕微促進(jìn)作用有一定的關(guān)系。
　　 (3)在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中，考察滲透壓調(diào)節(jié)劑的添加對重組E.coli胞外生產(chǎn)α-CGT酶的影響。研究結(jié)果表明，

5、蔗糖和山梨醇對菌體的生長有較好的促進(jìn)作用，其他添加劑對菌體的生長都有不同程度的抑制作用。而只有添加L-脯氨酸和鈉離子對胞外生產(chǎn)α-CGT酶有促進(jìn)作用，當(dāng)脯氨酸和鈉離子的添加濃度分別為75 mM和500 mM時，胞外酶活分別是對照組的2.02倍和4.2倍。
　　 (4)以SDS、Na+、甘氨酸和Ca2+為四個因素，以實(shí)現(xiàn)α-CGT的高產(chǎn)量為目標(biāo)設(shè)計Lg(34)正交實(shí)驗(yàn)，正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響產(chǎn)酶的各種因素的主次因子順序?yàn)楦拾彼?/p>

6、> SDS>Na+> Ca2+。大腸桿菌胞外生產(chǎn)α-CGT酶的最佳工藝條件為添加0.03% SDS，400 mM Na+，0.3%甘氨酸和10 mM Ca2+。發(fā)酵條件優(yōu)化后得到的酶產(chǎn)量比優(yōu)化前的酶產(chǎn)量提高了15倍左右，達(dá)到12.89 U/mL。
　　 (5)分別以O(shè)NPG和NPN熒光探針觀察重組E.coli細(xì)胞內(nèi)膜和外膜滲透性的變化，結(jié)果顯示，在發(fā)酵最佳工藝條件下培養(yǎng)的重組E.coli細(xì)胞內(nèi)外膜相對于對照組有更高的的滲透性，使

7、得重組α-CGT酶更容易釋放到胞外。
　　 (6)對重組E.coli細(xì)胞膜磷脂含量的分析表明:在發(fā)酵最優(yōu)工藝條件下培養(yǎng)的重組E.coli細(xì)胞膜中磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰乙醇胺(PE)含量分別為20.3%和71%，而在不含任何添加劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的重組E.coli細(xì)胞膜中PG和PE含量分別18.2%和75.8%。PG含量的增加，可能促進(jìn)了分泌伴侶蛋白SecA與膜的結(jié)合，同時促進(jìn)了前體目標(biāo)蛋白的跨膜運(yùn)出，從而提高了胞外重組α-CG

8、T酶的產(chǎn)量。
　　 (7)對重組E.coli細(xì)胞膜磷脂含量的分析表明：在發(fā)酵最優(yōu)工藝條件下培養(yǎng)的重組E.coli，其細(xì)胞膜中C16:1、C18:1和C19:1酸的百分含量都有所提高，分別從對照的1.3%、13.41%和2.28%提高到2.34%、20.85%和23.27%，C14:1酸的百分含量從對照的0.29%降低到0.11%。培養(yǎng)基添加劑的添加還促使膜脂中C17:0酸的百分含量從27.45%降低到26.11%。培養(yǎng)基添加劑可