大腸桿菌罕見單糖UDP-L-RhaNAc3NFo合成途徑及糖基轉(zhuǎn)移酶功能的鑒定.pdf

1、大腸桿菌是一種重要的條件致病菌，能引起腹瀉甚至導(dǎo)致死亡。大腸桿菌的毒性往往和其O抗原悉悉相關(guān)。O抗原位于革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖分子的最外層，一般由多個寡糖重復(fù)單位組成。O抗原具有高度多樣性，并對細(xì)菌細(xì)胞膜功能的完整性非常重要。對O抗原合成途徑的研究有利于揭示細(xì)菌的致病機(jī)理，也可為抗生素和疫苗等的研究和生產(chǎn)提供依據(jù)，從而使大腸桿菌引起的傳染病得到更好的治愈。
　　 在大腸桿菌O抗原中已鑒定了十幾種單糖的合成基因，本研究將對大腸桿菌中

2、罕見單糖L-RhaNAc3NFo的合成途徑以及糖基轉(zhuǎn)移酶的功能進(jìn)行鑒定。這不僅有助于加深我們對O抗原基因簇功能及其合成途徑的理解，也可為實現(xiàn)糖的體外合成奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究根據(jù)已獲得的O抗原結(jié)構(gòu)以及O抗原基因簇序列，利用生物信息學(xué)的手段，在實驗室前期工作基礎(chǔ)上完成了進(jìn)一步的預(yù)測。預(yù)測發(fā)現(xiàn)大腸桿菌G1059中的罕見單糖L-RhaNAc3NFo共由4個基因編碼的蛋白合成，分別為orf4、orf5、orf6和orf7，并對蛋白的功

3、能進(jìn)行了初步的預(yù)測。另外本研究還預(yù)測了大腸桿菌G3198和G2805中負(fù)責(zé)半乳糖轉(zhuǎn)移的糖基轉(zhuǎn)移酶orf11和wbwC基因的功能。
　　 本研究利用T7原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了相關(guān)基因的重組質(zhì)粒，并在E.coli BL21(DE3)中對目的蛋白進(jìn)行了表達(dá)，確立了目的蛋白的最適表達(dá)條件，同時對Orf4、Orf5、Orf6和Orf7蛋白進(jìn)行了純化。隨后建立了體外的酶促反應(yīng)，并采用毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜的方法對酶促反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。