利用重組蔗糖：蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶制備蔗果三糖的研究.pdf

1、低聚果糖（Fructooligosaccharides,FOS）是指在蔗糖分子的果糖殘基上通過(guò)β-1,2糖苷鍵連接1-3個(gè)果糖基而成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）及其它們的混合物。FOS是一種益生素，能刺激腸道中雙歧桿菌生長(zhǎng)，抑制外源致病菌和腸內(nèi)固有腐敗菌（如梭菌）的生長(zhǎng)繁殖，維持腸道微生態(tài)平衡，提高機(jī)體的免疫功能等功效。研究表明GF2是FOS作為益生素的有效成分。作為益生元重要代表之一的FOS已成為國(guó)內(nèi)外

2、研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，被譽(yù)為集營(yíng)養(yǎng)、保健、療效三位一體的21世紀(jì)健康新糖源。植物來(lái)源的蔗糖:蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶（Sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase,1-SST）催化2分子的蔗糖轉(zhuǎn)化成1分子的蔗果三糖和1分子的葡萄糖。本論文利用本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的含1-SST基因的基因工程菌通過(guò)發(fā)酵工程技術(shù)獲得重組1-SST，利用所產(chǎn)的重組酶體外轉(zhuǎn)化蔗糖制備GF2，為下一步的工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)GF2奠定基礎(chǔ)。
　　

3、在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 7.0實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)重組菌進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵工藝。首先，通過(guò) PB實(shí)驗(yàn)，從蔗糖、酵母提取物、NH4Cl、KH2PO4、初始pH、接種量及裝液量7個(gè)因素中篩選出影響重組菌產(chǎn)酶的顯著因素；然后，通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)最大限度地接近最佳產(chǎn)酶區(qū)。最后，通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)條件。制備1-SST的最佳工藝條件為：蔗糖濃度0.6％、酵母提取物濃度0.3%、NH4Cl濃度0.3%、pH7.1，

4、其它組分和濃度與原始PPB培養(yǎng)基相同。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明重組菌在優(yōu)化后的發(fā)酵工藝中所產(chǎn)的酶活力為6.309 U/mL，比優(yōu)化前提高了55.5%。
　　對(duì)粗酶液酶學(xué)性質(zhì)的研究表明：1-SST的最適酶活反應(yīng)溫度范圍為30-40℃，在此范圍內(nèi)有較好的溫度穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度為35℃；1-SST的最適酶活反應(yīng) pH范圍為6.5-7.0，在此范圍內(nèi)有較好的pH穩(wěn)定性，最適pH為6.5。不同金屬離子對(duì)酶活力的影響不同，其中 Ca2+、Fe3+和Al

5、3+對(duì)重組1-SST的激活作用最明顯，Zn2+則有很強(qiáng)的抑制作用。通過(guò)Lineweaver-Burk作圖法，得到該酶的米氏常數(shù)Km為25.09 mmol/L。
　　對(duì)粗酶液體外制備蔗果三糖的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了研究。首先，對(duì)體外反應(yīng)的反應(yīng)溫度、不同pH緩沖體系和底物濃度進(jìn)行優(yōu)化；然后，在單因素的基礎(chǔ)上，對(duì)pH、底物濃度以及溫度進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，該工藝的最優(yōu)條件為反應(yīng)溫度33℃、底物濃度40 mg/mL以及pH6.7，并在此條件