G蛋白偶聯(lián)受體PKR2內(nèi)吞及激活ERK1-2的機(jī)制研究.pdf

1、PKs(Prokineticins)包括PK1、PK2兩種，兩者在結(jié)構(gòu)上具有高達(dá)50％的同源性。它們通過(guò)與兩種高度相似的G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCRs）:PKR1和PKR2相結(jié)合，參與胃腸道平滑肌收縮、血管生長(zhǎng)、疼痛性感受、進(jìn)食、生物節(jié)律、炎癥反應(yīng)和情緒調(diào)節(jié)等一系列生理過(guò)程。PKR2和PK2的突變與卡爾曼綜合征、低促性腺素性功能減退癥有關(guān)。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，用PK2刺激表達(dá)PKR2的細(xì)

2、胞導(dǎo)致PKR2受體快速內(nèi)吞，并在配體移除后又能重新回到細(xì)胞膜上，但是PKR2內(nèi)吞的具體機(jī)制目前還不清楚。用PK2刺激表達(dá)PKR2受體的細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2)的瞬時(shí)磷酸化，但這一過(guò)程的具體作用機(jī)制還不清楚。
　　目的:
　　闡明PKR2內(nèi)吞以及PKR2活化引起ERK1/2磷酸化的分子機(jī)制。
　　方法:
　　(1)

3、通過(guò)激光共聚焦方法，分析GFP標(biāo)記的PKR2受體在膜上以及細(xì)胞質(zhì)中的分布比例，來(lái)研究PKR2的內(nèi)吞。過(guò)表達(dá)顯性負(fù)效應(yīng)的蛋白（如GRK2、β-arrestin），RNA干擾以及化合物等方法影響GRK2、β-arrestin、網(wǎng)格蛋白、蛋白激酶C的功能，檢測(cè)上述分子在配體引起的PKR2內(nèi)吞以及PKR2的異源內(nèi)吞中的作用;通過(guò)WesternBlot檢測(cè)ERK1/2的磷酸化。
　　(2)通過(guò)加入各種抑制劑，研究受體內(nèi)吞、蛋白激酶C、表皮生

4、長(zhǎng)因子受體、磷脂酶Cβ(PLCβ)以及MEK在PKR2活化導(dǎo)致ERK1/2磷酸化中的作用。
　　結(jié)果:
　　(1) PK2誘導(dǎo)的PKR2內(nèi)吞需要GRK2和網(wǎng)格蛋白的參與，但并不需要β-arrestin蛋白的參與。
　　(2) PKC活化可導(dǎo)致PKR2受體的異源內(nèi)吞，但是PKC的活化不是PK2誘導(dǎo)的PKR2受體內(nèi)吞所必須的。
　　(3) PKR2活化引起的ERK1/2磷酸化不需要PKR2內(nèi)吞、PKC活化以及EGFR