hsBAFF通過(guò)Ca2+-CaMKII依賴抑制PP2A激活Erk1-2導(dǎo)致B細(xì)胞增殖機(jī)理研究.pdf

1、本研究運(yùn)用RAN干擾、Western bloting、細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞儀等細(xì)胞學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)在體、離體實(shí)驗(yàn)，研究了PP2A活性與Erk1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在hsBAFF激活B淋巴細(xì)胞增殖中的作用;通過(guò)使用鈣離子螯合劑或CaMKⅡ抑制劑，進(jìn)一步探討了hsBAFF上調(diào)B淋巴細(xì)胞[Ca2+]i與PP2A活性表現(xiàn)以及Erk1/2激活的關(guān)系，本研究旨在為理解BAFF調(diào)節(jié)體液免疫機(jī)制和相關(guān)疾病的防治提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。結(jié)果如下:
　　

2、1、hsBAFF通過(guò)抑制PP2A激活Erk1/2促進(jìn)B細(xì)胞增殖
　　在體小鼠實(shí)驗(yàn)，選取40只ICR健康小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成對(duì)照組和4個(gè)不同劑量hsBAFF處理組，每組8只。處理組每日按照含hsBAFF0.1、0.5、1和2 mg/kg體重的PBS溶液進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組注射同等劑量的PBS溶液。在注射8天后，用抗CD19磁珠分離純化脾臟B淋巴細(xì)胞。離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，分別接種6、24或96孔培養(yǎng)板的Raji細(xì)胞和/或分離純化原代B淋

3、巴細(xì)胞，用0-5μg/mlhsBAFF處理12或48 h、或用2.5μg/ml hsBAFF處理0-24 h。以上實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖活性、PP2A和Erk1/2蛋白表達(dá)變化。采用Ad-MKK1-R4F、Ad-MKK-K97M感染Raji細(xì)胞分別持續(xù)激活或鈍化MKK活性，或用Ad-PP2A-wt感染Raji細(xì)胞過(guò)表達(dá)PP2A，論證PP2A-Erk1/2信號(hào)級(jí)聯(lián)在hsBAFF促進(jìn)B細(xì)胞增殖中的作用。結(jié)果顯示: hsBAFF注射小鼠8天后，脾臟

4、B淋巴細(xì)胞增殖活性呈現(xiàn)劑量依賴性升高，并且可見(jiàn)PP2A去甲基化和磷酸化及Erk1/2磷酸化也呈hsBAFF劑量依賴增加。離體實(shí)驗(yàn)顯示，hsBAFF促進(jìn)B細(xì)胞增殖與其抑制PP2A活性導(dǎo)致Erk1/2磷酸化增加有密切關(guān)系。這被持續(xù)激活MKK1強(qiáng)化hsBAFF誘導(dǎo)Erk1/2磷酸化和B細(xì)胞增殖作用，而鈍化MKK1使得hsBAFF誘導(dǎo)Erk1/2磷酸化和增殖減弱，以及PP2A過(guò)表達(dá)部分地阻止hsBAFF激活Erk1/2和B細(xì)胞增殖證據(jù)支持。提示

5、:hsBAFF通過(guò)抑制PP2A激活Erk1/2促進(jìn)B細(xì)胞增殖。
　　2、hsBAFF通過(guò)Ca2+-CaMKⅡ依賴抑制PP2A誘導(dǎo)Erk1/2激活和B細(xì)胞增殖
　　將培養(yǎng)的Raji細(xì)胞接種于6或24孔培養(yǎng)板，在1和2.5μg/ml hsBAFF單獨(dú)作用及與抑制劑聯(lián)合作用12h或48 h，各種抑制劑BAPTA/AM、EGTA、2-APB或KN93在加hsBAFF前預(yù)處理1h。Western blot檢測(cè)PP2A活性和Erk1/2

6、激活狀態(tài)、細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)估B細(xì)胞增殖表現(xiàn)。結(jié)果顯示:BAPTA/AM、EGTA或2-APB削弱hsBAFF抑制PP2A活性，進(jìn)而降低Erk1/2磷酸化和B細(xì)胞增殖，表明hsBAFF抑制PP2A激活Erk1/2和B細(xì)胞增殖是Ca2+依賴的。CaMKⅡ抑制劑KN93通過(guò)削弱hsBAFF誘導(dǎo)PP2A活性抑制明顯阻止Erk1/2磷酸化和B細(xì)胞增殖，表明hsBAFF刺激CaMKⅡ抑制PP2A激活Erk1/2和B細(xì)胞增殖。本研究提示:hsBAFF通過(guò)C