長梗木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆與表達研究.pdf

1、一株高產(chǎn)纖維素酶的真菌菌株經(jīng)形態(tài)學鑒定和ITS rDNA序列分子鑒定并被命名為長梗木霉SSL(Trichoderma longibrachiatum，SSL)。 利用PCR和RT-PCR的技術(shù)從該菌株中擴增得到內(nèi)切-1-4-β-D-葡聚糖酶I、III、IV基因(egI、egIII、egIV)的DNA序列和cDNA序列，其cDNA序列全長依次為：egI基因1386 bp，eglII基因1257 bp，egIV基因1044 bp。這

2、三個基因的GenBank登錄號分別為：EU935217，F(xiàn)J040191，F(xiàn)J040192。將三基因編碼的氨基酸序列分別與其它同源的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)與里氏木霉、綠色木霉的EGI EGIH EGIV具有很高的同源性。 將編碼egI基因和egIII基因的成熟肽編碼序列分別插入到畢赤酵母表達載體pPIC9k中，使其位于α因子信號肽序列的下游，構(gòu)建獲得重組表達質(zhì)粒pPIC9k-egI和pPIC9k-egiII。重組表達質(zhì)粒采用電

3、轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入到畢赤酵母(P.pastoris)GS115菌株中，經(jīng)篩選獲得分泌重組內(nèi)切葡聚糖酶的酵母工程菌株pPIC9k-egI-GS115和pPIC9k-egiII-GS115。重組P.pastoris菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，胞外重組內(nèi)切葡聚糖酶I的活力達到73 U/mL，重組內(nèi)切葡聚糖酶III的活力達到110 U/mL。在各自的SDS-PAGE中也均出現(xiàn)了明顯加強的蛋白質(zhì)條帶。 對pPIC9k-egIII-GS115轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶的