內(nèi)切葡聚糖酶基因克隆、表達(dá)、純化及免疫學(xué)鑒定.pdf

1、本試驗(yàn)采用RT-PCR法以黑曲霉(Aspergillus niger)菌株總：RNA為模板克隆內(nèi)切葡聚糖酶基因cDNA序列。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序表明EG-B基因全長(zhǎng)999bp，GC堿基含量為53.95％，以ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子，編碼332個(gè)氨基酸組成的多肽，與參考內(nèi)切葡聚糖酶Eng1基因(Genebank NO.AF331518)核苷酸同源性為98％，氨基酸同源性為99％。。氨基酸序列分析表明該內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖基水解酶

2、家族5。將該基因擴(kuò)增至pMD19-T simple載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，構(gòu)建重組質(zhì)粒CTB256-T-1和CTB256-T-2。其中CTB256-T-2 PCR擴(kuò)增出的目的基因成熟編碼區(qū)與PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果完全一致。 在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoR I/HindⅢ完成了原核表達(dá)載體構(gòu)建：將經(jīng)雙酶切鑒定正確的原核融合表達(dá)質(zhì)粒pET-28a/EG-B在大腸桿菌BL21(DE3)中充分表達(dá)；并利用原核表

3、達(dá)載體pET-28a上N端融合組氨酸標(biāo)簽，將EG-B基因表達(dá)的目的蛋白經(jīng)Ni<'2+>-chelating和Heparin樹(shù)脂逐級(jí)分離純化：純化后的目的蛋白作抗原免疫家兔，制備多克隆抗體，Western blotting檢測(cè)確定EG-B基因表達(dá)的重組蛋白和黑曲霉(Aspergillus niger)菌株天然蛋白具有相同的抗原顯色反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果如下：(1)RT-PCR法克隆的EG-B基因與已發(fā)表黑曲霉(Aspergillus niger)

4、編碼內(nèi)切葡聚糖酶Eng1基因(Genebank NO.AF331518)核苷酸同源性為98％，氨基酸同源性為99％；(2)EG-B基因表達(dá)的目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為36.52KDa，蛋白的等電點(diǎn)為4.115； (3)EG-B基因表達(dá)的目的蛋白經(jīng)多級(jí)分離純化后酶比活力為180.8U/mg；(4)EG-B基因表達(dá)的重組蛋白和黑曲霉(dspergillus niger)菌株天然蛋白具有相同的抗原顯色反應(yīng)。以上試驗(yàn)結(jié)果可以得到同一個(gè)結(jié)論，即編碼黑