綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶高產(chǎn)菌株的誘變及組分Ⅱ基因的克隆表達(dá).pdf

1、本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的一株酸性纖維素內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D—glucanase，EG)產(chǎn)生菌綠色木霉(Trichodermaviride)WL0512(酶活性2411.1U/g干曲)作為原始出發(fā)菌株，通過(guò)自然分離篩選出一株產(chǎn)酶較穩(wěn)定的TVN-13(酶活性2565.0U/g干曲)作為誘變出發(fā)菌株，將TWN-13菌株用真空微波和甲基磺酸乙酯(EthylMethane—sulfonate，EMS)逐級(jí)誘變處理，獲得了一株高產(chǎn)、穩(wěn)

2、產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的突變株E6—6。該菌株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶活性達(dá)4659.1U/g干曲，是原始出發(fā)菌株WL0512酶活性的1.93倍。通過(guò)對(duì)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初步優(yōu)化，使突變株的產(chǎn)酶能力提高了14.1％，達(dá)到5316.3U/g干曲。對(duì)E6—6所產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示其為酸性酶。 根據(jù)GenBank報(bào)道的來(lái)源于木霉屬的內(nèi)切葡聚糖酶II基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，采用RT—PCR方法擴(kuò)增得到綠色木霉突變株E

3、6—6和出發(fā)菌株TVN-13的內(nèi)切葡聚糖酶成熟肽基因egII和egII’的cDNA序列，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pTG19—T—egII和pTG19—T—egII’，測(cè)序發(fā)現(xiàn)兩序列同源性為100％。egII全長(zhǎng)1194bp，編碼397個(gè)氨基酸，理論分子量為42.2kDa。利用Blast軟件進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)egII的氨基酸序列同編碼木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列同源性最高達(dá)到94％，將該基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)EF602036

4、)。 將內(nèi)切葡聚糖酶egII基因序列插入大腸桿菌(Escherichiacoli)表達(dá)載體pET-28aq(+)的NcoI和HindIII酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pET-28a(+)—egII，將該質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析顯示，重組菌BL21(DE3)/egII胞內(nèi)胞外均未無(wú)明顯特異性蛋白條帶；Rosettaq(DE3)/egII胞內(nèi)出現(xiàn)分子量

5、約為42kDa特異性蛋白條帶，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白表達(dá)量增大，但很難檢測(cè)到內(nèi)切葡聚糖酶活性。 將內(nèi)切葡聚糖酶egII基因序列插入畢赤酵母(Pichiapastoris)穿梭質(zhì)粒pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pPIC9K—egII。將該質(zhì)粒經(jīng)NcoI線性化后電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，內(nèi)切葡聚糖酶在重組畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，搖床水平上培養(yǎng)96h酶活性達(dá)到15.48U/mL；胞內(nèi)