基因芯片技術(shù)在黃曲霉毒素生物合成相關(guān)基因檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是最常見的一類真菌毒素，廣泛分布于土壤、動植物特別是花生、玉米等人類傳統(tǒng)農(nóng)作物中。因其對人和動物肝臟組織有嚴(yán)重的破壞作用，并可導(dǎo)致肝癌甚至死亡而被世界衛(wèi)生組織定為Ⅰ致癌物。 本文采用Plackett-Burman(PB)試驗篩選出對毒素產(chǎn)量影響顯著的生長因子，然后采用響應(yīng)曲面法研究了各關(guān)鍵因子對寄生曲霉AS3.4407和黃曲霉AS3.4408產(chǎn)毒的影響以及它們間的交互作用，得出菌株產(chǎn)毒量

2、最低和最高時所對應(yīng)的環(huán)境條件，為實踐中糧食作物等的AFT污染控制提供理論依據(jù)和針對性措施。此外，本實驗結(jié)合RT-PCR方法成功建立了基因芯片制備技術(shù)，搭建了可用于分析黃曲霉毒素生物合成相關(guān)基因的生物芯片技術(shù)平臺，并篩選出與產(chǎn)毒相關(guān)的6個差異表達基因，初步分析了差異表達基因與黃曲霉毒素產(chǎn)生的相關(guān)性。為高通量篩選真菌中與產(chǎn)真菌毒素相關(guān)的基因提供技術(shù)支持。主要研究結(jié)果如下： 1.建立了改進的HPLC聯(lián)合熒光檢測器檢測黃曲霉毒素的方法。

3、用三倍體積氯仿提取樣品中的黃曲霉毒素B1。用HPLC-熒光檢測器檢測。HPLC的色譜條件為：反相C18柱(250×4.6mm)，流動相為甲醇∶乙腈∶水(30∶20∶50，v/v/v)，流速0.8mL/min。該法最低檢出限為2ng/mL，AFB1加標(biāo)量為6.25～1000ng/mL時，發(fā)酵液中AFB1的平均回收率為86.4～96.8％，變異系數(shù)小于7.0。提取液無需過柱純化，可以直接進行檢測。該方法不但可以將待檢毒素與其它雜質(zhì)有效分離，

4、而且可以同時檢測其它三種與AFB1結(jié)構(gòu)非常相似的AFB2、AFG1和AFG2。 2.通過PB試驗確定轉(zhuǎn)速、溫度和初始pH三因子對寄生曲霉AS3.4407的毒素產(chǎn)量影響顯著(p＜0.001)，利用中心組合設(shè)計建立了寄生曲霉產(chǎn)毒預(yù)測模型Y=338.45-7.98X1-7.82X2+43.25X3-34.1X21-26.93X22-22.9X23+5.35X1X2-10.76X1X3-0.069X2X3。由回歸模型來分別預(yù)測菌株產(chǎn)毒量

5、最高和最低時的環(huán)境條件及相應(yīng)產(chǎn)量，結(jié)果顯示寄生曲霉AS3.4407產(chǎn)毒量在最適條件下可達350ng/mL以上(轉(zhuǎn)速174rpm、溫度27.7℃、pH6.0)，而在不適條件下約為200ng/mL(轉(zhuǎn)速240rpm、溫度18.0℃、pH8.0)，實驗值與預(yù)測值之間的相關(guān)系數(shù)為0.99，證明應(yīng)用此模型能夠很好地預(yù)測不同生長環(huán)境條件下的產(chǎn)毒情況。 3.通過PB試驗確定時間、溫度和裝液量三因子對黃曲霉AS3.4408的毒素產(chǎn)量影響顯著(p

6、＜0.001)，利用Box-Behnken實驗設(shè)計建立了黃曲霉產(chǎn)毒預(yù)測模型Y=598-46.25x1+33.13x2-25.63x3-124.63x1x2-108.38x1x3-48.37x2x3-47.5x12-45x22+88.75x32。通過對響應(yīng)面的分析，得到較高毒素產(chǎn)量(＞500ng/mL)的培養(yǎng)條件范圍分別為，溫度27～29℃，裝液量55～65mL/250mL，時間7～10天。通過解二次回歸方程，可知在27℃，64.5mL/

7、250mL和培養(yǎng)9天條件下可得到最高毒素產(chǎn)量606ng/mL。預(yù)測值和實測值有良好的相關(guān)性。 4.以Genebank中公布的基因序列信息為背景設(shè)計了27對引物，通過RT-PCR從高產(chǎn)毒寄生曲霉AS3.4407總RNA中擴增獲得與黃曲霉毒素生物合成相關(guān)的25個基因片段和一個陽性對照基因片段β-tublin，從大腸桿菌基因組中擴增得到一個陰性對照基因片段LacZ，將它們作為芯片點陣的探針。為獲得一致的雜交溫度，設(shè)計合成的探針片段長度

8、均為400bp。 5.建立了比較成熟的可用于分析黃曲霉毒素生物合成相關(guān)基因的芯片技術(shù)。研究表明芯片點陣后依次通過溫浴2h，650mJ/cm2紫外交聯(lián)30s，80℃烘烤2h，預(yù)雜交45min，清洗，干燥等步驟，最后與待測樣品在42℃雜交16h，可獲得低背景高質(zhì)量的芯片。初步建立了可用于分析黃曲霉毒素生物合成相關(guān)基因的芯片技術(shù)平臺。 6.采用誘導(dǎo)產(chǎn)毒培養(yǎng)的方法培養(yǎng)寄生曲霉AS3.4407，獲得產(chǎn)毒與不產(chǎn)毒兩種性狀的菌絲體。應(yīng)