黃曲霉毒素B1的生物降解及其在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用研究.pdf

1、鑒于霉菌毒素B1(AFB1)的嚴(yán)重污染及其對(duì)人類和動(dòng)物健康的嚴(yán)重危害，采取有效措施對(duì)霉菌毒素進(jìn)行脫毒處理成為函待解決的問題。本文通過篩選得到對(duì)黃曲霉菌生長及AFB1降解效果較好的菌株，并對(duì)AFB1降解酶進(jìn)行分離純化，之后將益生菌與AFB1降解酶配合應(yīng)用于肉雞生產(chǎn)中，觀察其對(duì)肉雞飼料中AFB1的解毒效果，為其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　(1)通過測定菌絲重量和AFB1產(chǎn)量，篩選對(duì)黃曲霉菌生長和產(chǎn)毒抑制效果最好的乳酸菌、枯草芽孢

2、桿菌和酵母菌，并通過正交試驗(yàn)篩選對(duì)黃曲霉菌生長和產(chǎn)毒抑制效果最好的益生菌組合。結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌上清液對(duì)黃曲霉生長的抑制效果最好，抑制率高達(dá)81.87％，乳酸菌上清液抑制產(chǎn)毒效果最好，上清液中AFB1含量僅為4.69μg/L，抑制率高達(dá)97.09％。乳酸菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌單獨(dú)培養(yǎng)后以2∶1∶2的比料混合，對(duì)霉菌生長和AFB1產(chǎn)量具有顯著抑制作用（P≤0.05）。
　　(2)在微生物的液體培養(yǎng)基中添加高濃度的AFB1，通過測

3、定培養(yǎng)液中細(xì)胞干重、吸光度值以及pH觀察微生物的生長情況，初步判斷乳酸菌A2和4株枯草芽孢桿菌均具有較高的AFB1降解能力，其中枯草芽孢桿菌B4的降解率最高，達(dá)到38.38％(P≤0.05)。乳酸菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌單獨(dú)培養(yǎng)后以2∶1∶2的比例混合對(duì)AFB1的降解試驗(yàn)中，48h時(shí)對(duì)AFB1的降解率最高，達(dá)到82.72％(P≤0.05)。
　　(3)通過正交試驗(yàn)，研究益生菌組合與酵母細(xì)胞壁、寡糖配伍對(duì)AFB1的降解作用。研究表明

4、:益生菌組合與酵母細(xì)胞壁和寡糖配伍與僅使用益生菌組合對(duì)AFB1的降解效果差異不顯著(P＞0.05)，對(duì)AFB1的降解率分別為88.30％和85.05％。因而，在后期試驗(yàn)中，僅選擇益生菌組合來研究其對(duì)AFB1的降解效果。
　　(4)以AFB1作為碳源和能源進(jìn)行AFB1降解菌株的篩選。篩選得到的細(xì)菌和真菌對(duì)AFB1的降解率分別為58.04％和77.05％。對(duì)降解AFB1的真菌進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)，提取AFB1降解酶粗酶液并通過離子交換層析

5、和凝膠層析，對(duì)AFB1降解酶進(jìn)行分離純化。通過凝膠層析分離出蛋白分子量約為33.7KDa的AFB1降解酶，對(duì)AFB1的降解率達(dá)54.33％。經(jīng)過16SrDNA和26SrDNA的鑒定結(jié)果顯示，篩選得到的AFB1降解細(xì)菌為枯草芽孢桿菌，真菌為米曲霉。
　　(5)鑒于分離純化后AFB1降解酶的降解效率低于粗酶液，將益生菌組合與AFB1降解酶的粗酶液以不同比例混合，測定其對(duì)AFB1的降解能力。結(jié)果表明，益生菌組合與AFB1降解酶按2∶3的

6、組合比例對(duì)AFB1的降解效果最好，對(duì)AFB1的降解率達(dá)78.07％。
　　(6)將益生菌和AFB1降解酶添加到含有AFB1的飼料中，通過測定肉雞生產(chǎn)性能、血清和肝臟相關(guān)酶活性、抗氧化指標(biāo)及其相關(guān)基因表達(dá)量的變化等指標(biāo)，研究益生菌和AFB1降解酶對(duì)肉鴆飼料中AFB1的解毒效果。飼養(yǎng)試驗(yàn)分為前期(1～21d)、中期(22～42d)和后期(43～72d)三個(gè)階段。前期選擇1d健康A(chǔ)A肉仔鴆200只，分為5個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重

7、復(fù)8只雞。中期在前期原處理內(nèi)選擇150只雞，分為5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只雞。后期選擇75只雞，將各組雞只混合重新分為5組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3只雞。在前期和中期試驗(yàn)中，A組為基礎(chǔ)日糧（對(duì)照組），B（負(fù)對(duì)照組）、C、D和E組分別在基礎(chǔ)日糧添加100μg/kg的AFB1，并按照0、0.05％、0.10％和0.15％的比例分別添加益生菌和AFB1降解酶的復(fù)合物。在后期試驗(yàn)中，A組為基礎(chǔ)日糧（對(duì)照組），B、C、D和E組分別在基礎(chǔ)日糧添加AFB

8、1量為400、200、400和800μg/kg，除B組不添加益生菌和AFB1降解酶的復(fù)合物外（負(fù)對(duì)照組），C、D和E組分別在基礎(chǔ)日糧添加0.15％益生菌和AFB1降解酶。其主要結(jié)果如下:
　　在試驗(yàn)前期，與負(fù)對(duì)照B組相比，添加益生菌和AFB1降解酶的各組肉鴆的末重、平均日增重均有不同程度的提高，死亡率和腹瀉率均有顯著降低（P≤0.05），其中添加量最大的E組與B組相比，末重和平均日增重分別提高了11.59％和16.87％(P≤0.

9、05)，腹瀉率和死亡率分別降低了56.58％和88.89％，且肝臟和法氏囊的重量均有顯著提高（P≤0.05）。與其它處理組相比，B組粗脂肪和磷代謝率顯著降低（P≤0.05）。日糧中添加益生菌和AFB1降解酶顯著降低了十二指腸中大腸桿菌的數(shù)量(P≤0.05)，顯著提高了盲腸中乳酸菌的數(shù)量（P≤0.05），肌胃、十二指腸、回腸和盲腸中蛋白酶活力皆有顯著提高（P≤0.05），血清中間接膽紅素、低密度脂蛋白、谷酰轉(zhuǎn)肽酶和總抗氧化能力顯著升高(P

10、≤0.05)，各處理組基因組DNA無顯著變化?？傮w來看，由于前期基礎(chǔ)日糧中AFB1的含量過高，各處理組雞只的生產(chǎn)性能均受到了嚴(yán)重抑制，但益生菌和AFB1降解酶的解毒效果得到了充分的體現(xiàn)。
　　在試驗(yàn)中期，添加益生菌和AFB1降解酶的各組雞只除了腹瀉率顯著降低外（P≤0.05），其它各項(xiàng)生產(chǎn)性能各處理組之間無顯著差異(P＞0.05)。與其它處理組相比，B組的粗蛋白質(zhì)代謝率顯著降低（P≤0.05）。D和E組全凈膛率顯著地高于B組(P≤

11、0.05)。添加益生菌和AFB1降解酶的各處理組雞的十二指腸、回腸和盲腸的總細(xì)菌數(shù)均顯著顯著高于A和B組（P≤0.05）。與B組相比，日糧中添加益生菌和AFB1降解酶對(duì)各處理組雞回腸淀粉酶活力和盲腸脂肪酶活力皆有顯著提高(P≤0.05)。與對(duì)照組相比，添加益生菌和AFB1降解酶各組雞血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶的活力皆有顯著提高（P≤0.05），谷胱甘肽過氧化物酶皆有不同程度的下降(P≤0.05);肝臟和胸肌中AFB1含量無顯著差異(P＞0.05)

12、，但B和D組雞肝臟DNA有部分損傷。
　　在試驗(yàn)后期，添加益生菌和AFB1降解酶顯著緩解了AFB1對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的抑制。AFB1添加量為200μg/kg的C組，雞只的末重、平均日增重、平均日采食量和料肉比顯著高于B、D和E組(P≤0.05)，與對(duì)照組無明顯的差別(P＞0.05)。而未添加益生菌和AFB1降解酶的B組和AFB1添加量達(dá)800μg/kg的E組體重則出現(xiàn)了負(fù)增長。同等AFB1添加量的B組和D組，因?yàn)镈組添加了益生菌和AF

13、B1降解酶，其體重、平均日增重、平均日采食量和料肉比均顯著高于B組，平均日采食量和末重分別提高了23.39％和29.81％(P≤0.05)。與B組相比，其余各組的有機(jī)物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、鈣和磷的代謝率均顯著提高(P≤0.05)。隨AFB1添加量的增加，顯著降低了肉雞的屠宰性能;但AFB1添加量較小的C組，屠宰率、全凈膛率、腹脂、脾臟和肌胃的重量與B組相比皆有顯著提高(P≤0.05)。各處理組十二指腸的總菌數(shù)顯著升高（P≤0.05），大腸桿菌

14、數(shù)目顯著降低（P≤0.05）;十二指腸和回腸淀粉酶活力、肝臟超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和總抗氧化能力均有顯著提高(P≤0.05)。毒素添加量最大的E組，肝臟基因組DNA損傷嚴(yán)重?？傮w來看，在AFB1含量為200μg/kg的肉雞飼料中添加0.15％的益生菌和AFB1降解酶，可以顯著緩解AFB1對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的不良影響，這為AFB1的生物降解和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　(7)根據(jù)生產(chǎn)性能指標(biāo)選擇43-72d時(shí)A、B和D組的公雞各3

15、只，將肝臟樣品等比例混合后進(jìn)行肝臟中相關(guān)基因表達(dá)量的測定。結(jié)果表明:對(duì)于氧化還原酶系來說，A組與B組相比，B組表達(dá)量下調(diào)的基因占表達(dá)量發(fā)生變化的基因總數(shù)的62.5％;B組與D組相比，D組的大多基因表達(dá)量均出現(xiàn)了上調(diào)。對(duì)于細(xì)胞生長酶系來說，B組與D組相比，D組的基因表達(dá)量均出現(xiàn)了下調(diào)。對(duì)于免疫過程控制相關(guān)酶系來說，B組與D組相比，D組的基因表達(dá)量發(fā)生上調(diào)和下調(diào)的各占50％。對(duì)于代謝過程控制相關(guān)酶系來說，A組與B組相比，B組的大多基因的表達(dá)