bkdF基因和nsdA基因中斷對阿維鏈霉菌次級(jí)代謝的影響.pdf

1、bkdF基因和nsdA基因是在阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)基因組中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)與阿維鏈霉菌次生代謝和分化發(fā)育密切相關(guān)的基因。bkdF的基因產(chǎn)物作為支鏈α酮酸脫氫酶(branched-chainαketoaciddehydrogenase，BCDH)復(fù)合體的E1α亞基參與了avermectin起始單元的生物合成。bkdF基因缺失會(huì)導(dǎo)致阿維鏈霉菌產(chǎn)阿維菌素能力的喪失。nsdA基因(negativeregulat

2、orofstreptomycesdifferentiation)是一個(gè)在鏈霉菌基因組中廣泛存在的全局性負(fù)調(diào)控因子，天藍(lán)色鏈霉菌的nsdA基因中斷菌株能夠提前且超量產(chǎn)生放線紫紅素、鈣依賴抗生素和次甲基霉素，同時(shí)產(chǎn)孢量也相應(yīng)增多。本研究的目的是利用基因置換技術(shù)中斷阿維鏈霉菌的bkdF基因和nsdA基因，研究它們對阿維鏈霉菌次級(jí)代謝的影響。 本研究采用了一種嶄新的PCR介導(dǎo)的基因中斷技術(shù)用于bkdF基因中斷菌株的構(gòu)建。合成一對長度分

3、別為58，59nt的引物，其5’端的39nt序列分別與bkdF基因兩側(cè)同源，3’端則分別與安普霉素抗性標(biāo)記盒(aac(3)Ⅳ+oriT)兩側(cè)序列一致。以該引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化能表達(dá)λRed重組酶且含有目標(biāo)質(zhì)粒的Escherichia.coli菌株BW25113/pIJ790/pXW1224，獲得了陽性重組質(zhì)粒pXW1230。將該質(zhì)粒中的約4kbBglⅡ酶切片段插入基因置換載體pHZ1351，再接合轉(zhuǎn)移至阿維鏈霉菌BIB9903，篩

4、選得到表型為ApraRThioS的接合子BIB0423。PCR驗(yàn)證bkdF基因已被正確中斷。對BIB0423的發(fā)酵分析以及HPLC和MS分析顯示，重組菌的阿維菌素合成途徑被完全阻斷，發(fā)酵產(chǎn)物為單一組分寡霉素A。 以pHL214為nsdA基因置換載體，接合轉(zhuǎn)移至阿維鏈霉菌BIB9903中，篩選得到nsdA中斷菌株BIB0515，PCR驗(yàn)證BIB0515中nsdA基因已被正確中斷。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，中斷菌株BIB0515的表型發(fā)生了較