基于微流控芯片的免疫傳感器和蛋白質組學研究.pdf

1、微流控芯片已經(jīng)在生物化學、醫(yī)學檢驗、藥物合成篩選、環(huán)境監(jiān)測等領域得到了廣泛的應用。微流控芯片結合了生物技術和微電子加工技術等,將實驗室中多種儀器的功能集成到芯片上進行處理,具有微型化、檢測效率高、操作簡單、檢測成本低、易于集成化等優(yōu)點。目前普遍使用的微流控芯片的制作材料是高分子聚合材料,但是其仍存在非特異性吸附等問題。研究結果表明,對高分子材料表面進行修飾改性可以改善它的性質,使聚合物芯片更有利于實際生物樣品分析。本論文以高分子聚合物芯

2、片為分析平臺,通過有效的修飾方法對微流控芯片通道表面進行修飾和改性,成功實現(xiàn)了芯片通道內生物分子的固定,為生物分析提供了新的研究方法。
　　論文的第一章綜述了微流控芯片加工方法、制作材料、檢測技術和實際應用等方面的研究進展,并強調了對微流控芯片通道表面進行改性和修飾的必要性和重要性;同時,詳細介紹了免疫分析、生物傳感器和蛋白質組學的發(fā)展狀況、主要研究內容和應用領域;最后總結了本論文研究的目的和意義。
　　本論文研究工作分為三

3、章,以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)微流控芯片作為研究對象,分別采用不同的表面修飾方法,包括聚乙烯亞胺衍生法、納米金膠層層組裝法、氧化鋁溶膠-凝膠法,將S100B蛋白抗體、核酸適配體和胰蛋白酶有效地固定在微流控芯片通道表面,發(fā)展了以微流控芯片為技術平臺的酶聯(lián)免疫分析、核酸適配體特異識別蛋白定量分析以及酶反應器用于蛋白鑒定的新方法。具體內容如下:
　　一、基于核酸適配體的微流控芯片用于生物傳感器的分析研

4、究
　　本工作將核酸適配體(aptamer)固定在納米金顆粒修飾的PMMA微流控芯片通道的內表面,利用篩選出來的核酸適配體能夠高度特異性地識別人凝血酶蛋白的特點,進而將凝血酶蛋白捕獲在芯片表面,同時凝血酶蛋白再與標記有生物素的二級核酸適配體相結合,最后利用生物素-親和素特異性相互作用的性質,將堿性磷酸酶固定,堿性磷酸酶可以催化底物產(chǎn)生靈敏的電化學信號,從而達到檢測人凝血酶蛋白的目的。本方法同時結合了微流控芯片反應速度快、耗樣量少、

5、靈敏度高等優(yōu)點,最后測得的人凝血酶蛋白的檢出限可以達到1pM,線性范圍寬,從1pM～100pM,將該方法用于實際人血清樣品中凝血酶蛋白的檢測,結果令人滿意。
　　二、微流控芯片用于腦損傷標志物S100B蛋白的高靈敏度分析檢測
　　在本工作中,我們發(fā)展了一種基于微流控芯片的電化學免疫傳感器用于低濃度的腦損傷標志物S100B的分析檢測。利用聚乙烯亞胺(PEI)對聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片通道表面進行氨基化修飾,用于S100

6、B蛋白抗體的固定。PEI是一種具有豐富氨基官能團的高分子聚合物,它能夠覆蓋在PMMA表面引入氨基官能團,因此被廣泛用于蛋白質和DNA的固定。S100B蛋白抗體固定后,通過抗原一抗體特異性反應,將S100B蛋白和堿性磷酸酶標記的二抗依次結合在一起,形成了微流控芯片通道內的具有三明治夾心結構的酶聯(lián)免疫反應體系。在芯片微通道的末端,利用三電極電化學檢測體系記錄下用堿性磷酸酶催化4-氨基苯基磷酸鹽(PAPP)時產(chǎn)生的還原電流信號,從而檢測S10

7、0B蛋白的濃度,檢出限低至0.1pgmL-1,線性范圍為0.1pgml-1～100pgmL-1。整個溫育反應過程和檢測過程被集成在微芯片裝置上,具有高靈敏度、特異性和分析時間短等優(yōu)點。因此,該方法為臨床免疫檢驗提供了一種新的多功能的檢測平臺。
　　三、氧化鋁溶膠.凝膠修飾微流控芯片酶反應器用于低豐度蛋白的酶解鑒定
　　本工作通過材料表面酯鍵的水解作用,產(chǎn)生-OH、-COOH等活性基團,進一步通過它們和溶膠一凝膠縮合反應,在聚

8、對苯二甲酸乙二醇酯(PET)芯片通道內部構建了溶膠-凝膠網(wǎng)絡結構,實現(xiàn)了胰蛋白酶的包埋固定,制備了Al2O3溶膠-凝膠修飾的PET芯片酶反應器,用于低豐度蛋白的檢測。Al2O3溶膠-凝膠固定在PET微流控芯片的通道表面,提供了一個具有親水性和生物相容性的界面,用于胰蛋白酶的包埋固定。由于將大量的胰蛋白酶限定在了狹小的微通道中,痕量的標準蛋白在幾秒內可以在芯片酶反應器上完成酶解步驟。我們從鼠肝細胞中提取的復雜樣品來評估Al2O3溶膠.凝膠