大黃魚免疫應(yīng)答的功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、大黃魚(Pseudosciana crocea)是我國特有的經(jīng)濟(jì)魚種，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，病害問題日益嚴(yán)重，已成為制約大黃魚養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的主要因素。因此，開展大黃魚免疫的分子基礎(chǔ)研究，揭示其免疫反應(yīng)規(guī)律及免疫的分子機(jī)制，不僅可以深化對以魚類為代表的低等脊椎動物免疫系統(tǒng)的認(rèn)識，也為大黃魚病害防治提供重要的理論依據(jù)。 本文首先采用雙向電泳分析了Poly(I：C)誘導(dǎo)不同時(shí)段大黃魚脾臟組織差異表達(dá)的蛋白，結(jié)合P

2、MF和MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜技術(shù)共鑒定了38個(gè)差異點(diǎn)，其中28個(gè)差異點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，10個(gè)表達(dá)下調(diào)，且表達(dá)變化多集中于誘導(dǎo)后12h-24h之間。為了了解各差異點(diǎn)間的相互關(guān)系以及它們在抗病機(jī)制中的作用，通過應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建了差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)其中有許多差異點(diǎn)如PPRAγ、Annexin IV、ROCK1等同時(shí)參與了免疫調(diào)節(jié)與凋亡調(diào)節(jié)，尤其是Annexin IV表現(xiàn)出多功能的特性。為了研究大黃魚Annexin IV的

3、功能，采用重組Annexin IV注射大黃魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Annexin IV的活體過表達(dá)能明顯提高Caspase3的酶活力，并促進(jìn)脾臟細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，它能抑制趨化因子CXC、CC的表達(dá)和上調(diào)抑炎因子IL-10的表達(dá)，表明了大黃魚Annexin IV具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的功能。在PolyI:C誘導(dǎo)后12h，Annnxin IV的上調(diào)可能在一定程度上促進(jìn)了脾臟細(xì)胞凋亡并抑制了炎性反應(yīng)，而誘導(dǎo)后48h，凋亡抑制因子PRDX I、AI

4、P的表達(dá)上調(diào)則有利于凋亡的抑制，從而調(diào)節(jié)PolyI：C誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)及維持免疫平衡。 通過比較對照組和三聯(lián)疫苗注射組的雙向電泳圖譜，找到了24個(gè)差異點(diǎn)，其中21個(gè)表達(dá)上調(diào)，3個(gè)表達(dá)下調(diào)。質(zhì)譜分析鑒定發(fā)現(xiàn)其中有許多與免疫應(yīng)答及炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)，尤其抗氧化蛋白酶家族成員如PRDX I、PRDX II、PRDX- IV在三聯(lián)疫苗誘導(dǎo)前后表達(dá)量都發(fā)生了改變，提示該家族可能在三聯(lián)疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。研究表明，人PRDX IV能通

5、過調(diào)節(jié)IκB的磷酸化來激活核因子NF-κB，但對其功能尚不清楚。為此，本文對大黃魚PRDX IV的分子特征及功能進(jìn)行了研究：體外實(shí)驗(yàn)表明重組的大黃魚PRDXIV具有明顯的抗氧化活性；免疫電鏡分析發(fā)現(xiàn)PRDX IV主要分布于脾臟細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過氧化物酶體中，并且三聯(lián)疫苗的免疫刺激促進(jìn)了PRDX IV在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的合成；針對PRDXIV的siRNA干擾可上調(diào)脾組織TNF-α2、CC趨化因子的表達(dá)水平，下調(diào)抑炎因子IL-10的表達(dá)，同時(shí)核因子NF

6、-κB(p65)的表達(dá)水平也明顯上升；PRDX IV的過表達(dá)則抑制了TNF-α2、CC趨化因子的表達(dá)，上調(diào)了IL-10的表達(dá)，核因子NF-κB(p65)的表達(dá)也受到明顯的抑制，說明了大黃魚PRDX IV具有抑制炎性反應(yīng)的功能。以三種混合活菌感染大黃魚，發(fā)現(xiàn)干擾組脾臟組織TNF-α2、CC及NF-κB(p65)的表達(dá)上調(diào)更加顯著，抑炎因子IL-10的表達(dá)明顯低于對照組，同時(shí)干擾組大黃魚的死亡率(94％)明顯高于過表達(dá)組(42％)和對照組(