5,6-二羥基-3,7,4’-三甲氧基黃酮醇化合物的抗肝癌活性及機制研究.pdf

1、目前惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴重危害人類健康的因素之一，其中肝癌的發(fā)病率及致死率更是呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。癌癥的發(fā)病機制復雜，其預防與治療一直備受關(guān)注，而在臨床上腫瘤耐藥更是化療失敗的罪魁禍首，尋找新型抗癌藥物是新藥研發(fā)的熱點。天然產(chǎn)物一直是癌癥治療先導化合物的重要來源。本課題研究的對象----化合物5，6-二羥基-3，7，4'-三甲氧基黃酮醇(AH5表示)就是從傳統(tǒng)中藥須彌紫菀中提取得到的一種黃酮類化合物。在本論文中，我們從抗腫瘤活性及細胞內(nèi)分

2、子機制兩方面對AH5進行系統(tǒng)研究。
　　本文首先MTT法檢測細胞毒性實驗表明該化合物對多種腫瘤細胞的生長有抑制作用，尤其對肝癌細胞作用最明顯，而對正常細胞毒性很小，對腫瘤細胞的抑制具有時間和劑量依賴性。不同濃度AH5作用細胞12 h，顯微鏡下觀察到細胞變圓，用流式細胞儀檢測到實驗組細胞有明顯的G2/M周期阻滯現(xiàn)象。繼續(xù)作用24小時，顯微鏡下觀察到細胞皺縮，核裂解，細胞膜出現(xiàn)小泡狀包裹細胞碎片，用凋亡試劑盒檢測細胞呈現(xiàn)明顯的凋亡狀態(tài)

3、。DAPI染色進一步驗證了凋亡小體的形成。Western blot蛋白免疫印跡法檢測了經(jīng)AH5處理的HepG2細胞中周期相關(guān)蛋白及caspases凋亡蛋白的表達變化。AH5降低cyclin B1的表達，上調(diào)p-cdc2蛋白水平，表明AH5能夠降低復合物cyclin B/cdc2的活性，使細胞阻滯在G2/M期。AH5作用的細胞中caspases-3，9的活化形式增加，這也標志著細胞凋亡的發(fā)生。以上結(jié)果表明，AH5具有誘導細胞G2/M阻滯和

4、凋亡的抗腫瘤活性。進一步研究AH5對HepG2細胞作用的分子機制。前面的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)AH5對HepG2（p53野生型）的作用敏感于其他肝癌細胞。Western blot和RT-PCR法檢測到p53及其調(diào)控細胞周期的下游靶基因p21在蛋白和基因表達水平都明顯升高。而PFT-α（p53轉(zhuǎn)錄特異性抑制劑）對AH5誘導的周期阻滯有明顯抑制作用。RT-PCR結(jié)果表明，p53及下游基因Bax的表達也增加。我們的實驗還發(fā)現(xiàn)AH5誘導的凋亡機制與線粒體

5、介導的途徑有關(guān)。結(jié)果顯示AH5處理細胞會出現(xiàn)明顯的線粒體膜電勢降低和細胞色素C釋放，激活caspases級聯(lián)反應，誘導凋亡。有文獻報道，細胞的應激作用能誘導p53在細胞質(zhì)中的累積，直接導致Bax寡聚化，進而誘發(fā)線粒體途徑的凋亡。免疫熒光染色和蛋白質(zhì)印跡分析亞細胞成分的實驗證實了p53轉(zhuǎn)錄非依賴線粒體途徑參與了AH5誘導的凋亡。抑制劑PFT-α和PFT-μ部分逆轉(zhuǎn)了AH5誘導的細胞存活率下降，線粒體膜電勢降低及凋亡作用，證實p53轉(zhuǎn)錄依賴