2’，5，6’，7-四羥基二氫黃酮醇的定向分離及其拮抗細(xì)菌膿毒癥的生物學(xué)活性評(píng)價(jià).pdf

1、膿毒癥是感染因素介導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)，是燒傷、創(chuàng)傷和感染性疾病患者的常見(jiàn)并發(fā)癥。流行病學(xué)資料顯示，每年全球有超過(guò)1800萬(wàn)的膿毒癥病例，且患者數(shù)目每年以1.0％速度遞增。重癥膿毒癥和膿毒性休克是重癥監(jiān)護(hù)病房(intensivecareunits，ICU)病人死亡的首要因素，死亡率高達(dá)50％-60％。 內(nèi)毒素(endotoxin/Lipopo

2、lysaccharide，LPS)是G￣菌外膜的主要成分，是介導(dǎo)細(xì)菌膿毒癥的重要病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)。LPS進(jìn)入機(jī)體內(nèi)后，首先與內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide-bindingprotein，LBP)結(jié)合，在LBP的作用下，LPS與單核/巨噬細(xì)胞膜上的受體CD14結(jié)合形成LPS-CD14復(fù)合物，復(fù)合物中的LPS與跨膜受體TLR4(T

3、olllikereceptor4，TLR4)結(jié)合，將信號(hào)轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致靶細(xì)胞的活化，釋放TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)膿毒癥的發(fā)生。盡管對(duì)膿毒癥的病理生理機(jī)制及其防治策略的研究較為深入，但至今仍無(wú)特殊有效的藥物供臨床治療。 中草藥在膿毒癥中的應(yīng)用具有悠久的歷史，已證實(shí)多種中草藥具有較好的拮抗內(nèi)毒素作用，但由于中藥成分復(fù)雜，加之缺乏有效的分離檢測(cè)手段，限制了中草藥在膿毒癥防治中的應(yīng)用與發(fā)展。在前期的研究中，我們將LPS的活性

4、中心LipidA包被于生物傳感器上，建立了以LipidA為靶點(diǎn)的篩選拮抗LPS藥物的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)?；诖思夹g(shù)平臺(tái)，本研究采用大孔吸附樹(shù)脂、超濾膜分離和高效液相色譜(highperformanceliquidchromatogram，HPLC)技術(shù)，對(duì)中藥水提液進(jìn)行多級(jí)分離純化，以期從天然藥物中獲取具有拮抗LPS活性的單體化合物，為膿毒癥防治藥物的研發(fā)提供新的思路和方法。 方法： 1.應(yīng)用以LipidA為靶點(diǎn)的生物傳感器技術(shù)平

5、臺(tái)，檢測(cè)60種中藥水煎液與LipidA的結(jié)合活性；對(duì)明確具有與LipidA結(jié)合活性的中藥，采用大孔吸附樹(shù)脂分離技術(shù)、超濾膜技術(shù)和HPLC技術(shù)進(jìn)行分離提取，應(yīng)用生物傳感器進(jìn)行活性追蹤監(jiān)測(cè)，收集能與LipidA結(jié)合的組分，并對(duì)其進(jìn)行針對(duì)LPS的體內(nèi)外生物學(xué)活性評(píng)估。對(duì)活性明確的有效組分，用HPLC作進(jìn)一步的分離純化，選擇與LipidA具有較高結(jié)合活性的HPLC產(chǎn)物作進(jìn)一步的研究，對(duì)所得單體化合物進(jìn)行純度分析和結(jié)構(gòu)解析。 2.對(duì)得到的

6、單體化合物進(jìn)行針對(duì)細(xì)菌膿毒癥的體內(nèi)外生物學(xué)活性評(píng)價(jià)，包括：①鱟試劑法檢測(cè)單體對(duì)LPS的體內(nèi)外中和作用；②ELISA法檢測(cè)單體對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(TNF-α和IL-6)的抑制作用；③RT-PCR法檢測(cè)單體對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TLR4和TNF-αmRNA表達(dá)的影響；④觀察單體化合物對(duì)膿毒癥模型小鼠的保護(hù)作用。 結(jié)果： 1.應(yīng)用生物傳感器技術(shù)平臺(tái)，從60種中藥中篩選出黃芩、胡連、赤芍、五倍子、訶子等5種具有與Li

7、pidA較高結(jié)合活性的中藥(RU＞200arcseconds)。以黃芩為研究對(duì)象，從黃芩水提液中分離出與LipidA具有結(jié)合活性的組分SbG-4；SbG-4(40mg/kg)能顯著提高熱滅活大腸埃希氏菌攻擊小鼠72h的存活率；物質(zhì)屬性鑒定SbG-4為黃酮類物質(zhì)。應(yīng)用膜分離技術(shù)從SbG-4中分離出分子量小于5000Da的5KL，5KL經(jīng)HPLC分離獲得5個(gè)HPLC組分(5KL-1～5)；在5個(gè)組分中，以5KL-1與LipidA的結(jié)合活性最

8、高；在體外5KL-1對(duì)LPS具有直接中和作用、可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α，體內(nèi)評(píng)價(jià)顯示5KL-1對(duì)膿毒癥模型小鼠具有顯著的保護(hù)作用；5KL-1經(jīng)HPLC進(jìn)一步分離后，得到5KL-1A、5KL-1B和5KL-1C三個(gè)產(chǎn)物；其中僅5KL-1B是單一物質(zhì)并與LipidA的結(jié)合活性最高，純度分析顯示，5KL-1B的純度因子為999.685；經(jīng)質(zhì)譜、核磁、紅外等波譜分析，對(duì)5KL-1B的結(jié)構(gòu)指認(rèn)為2’，5，6’，7-

9、四羥基二氫黃酮醇(2’，5，6’，7-tetrahydroxy-flavanonol，THF)，分子式為：C15H12O7。 2.對(duì)THF的活性研究顯示：①、THF在體內(nèi)外對(duì)LPS均具有直接中和作用；②、THF能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6，并具有明顯的量效關(guān)系；⑧、THF對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR4和TNF-α在mRNA水平的表達(dá)均具有顯著的抑制作用；④、THF對(duì)致死劑量熱滅活