凝乳酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及其發(fā)酵條件、產(chǎn)物酶學活性的相關(guān)研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、凝乳酶最初發(fā)現(xiàn)于未斷奶小牛的第四胃,是乳酪制造業(yè)中的關(guān)鍵性酶,同時在其他食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)等領(lǐng)域都有應(yīng)用,其在酶工業(yè)中所占的產(chǎn)值比例高達15%。近年來由于全球性小牛短缺,人們逐漸將目光投向牛凝乳酶的代用品,其中,微生物凝乳酶以其優(yōu)秀的凝乳性狀和便捷的生產(chǎn)工藝受到了最廣泛的關(guān)注。英、美、荷、日等國率先開始了微生物凝乳劑的相關(guān)研究,我國在80年代初亦開始進行相關(guān)研究,但目前還缺乏形成產(chǎn)業(yè)化的凝乳酶生產(chǎn)工藝,生產(chǎn)乳酪所需的凝乳酶主要依賴于進口

2、,因此進行凝乳酶的相關(guān)研究具有較高的經(jīng)濟和社會意義。本文主要進行了微生物發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的相關(guān)研究,內(nèi)容包括:凝乳酶高產(chǎn)菌株的誘變選育,發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及產(chǎn)物分離方法和酶學活性的初步研究。
   誘變實驗以購自ATCC的米黑毛霉、購自CICC的黑曲霉為出發(fā)菌株,分別對其依次進行紫外線照射誘變、脫氧膽酸鈉誘變和常壓低溫等離子體誘變。以產(chǎn)物凝乳活性和非特異性蛋白水解活性為考量標準,通過平板初篩和搖瓶發(fā)酵復篩,最后選育

3、一株凝乳酶產(chǎn)量高,蛋白質(zhì)水解活力小的黑曲霉突變株L-2-12。以該菌株作為發(fā)酵生產(chǎn)菌株,產(chǎn)物中凝乳酶產(chǎn)量是原始黑曲霉菌株的4.28倍;是原始米黑毛霉菌株的3.39倍。遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明,該誘變株基本保持產(chǎn)酶性狀穩(wěn)定。后續(xù)實驗以該菌株作為研究對象,試驗菌株使用干燥沙土管法低溫保存。
   微生物發(fā)酵是一個復雜的生理生化過程,不同菌株處于不同營養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)條件下,菌體的代謝均會不同從而影響產(chǎn)酶,因此要提高酶產(chǎn)量,對發(fā)酵產(chǎn)酶的條件

4、進行優(yōu)化是必不可少的一環(huán)。經(jīng)過對發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)組分和培養(yǎng)條件的單因素分析和發(fā)酵條件的Box-Behnken實驗研究,本文最終確立的培養(yǎng)條件為:每250mL錐形瓶分裝9g麩皮、1g面粉、0.1g脫脂乳粉,用15mL酸性無機離子營養(yǎng)液(按質(zhì)量體積比配制0.7%MgSO4·7H2O、0.9%FeSO4·7H2O、0.1%脯氨酸溶液,加0.2NHCl調(diào)節(jié)pH至6.61)浸潤,混勻并高溫滅菌,待涼后接種,37℃培養(yǎng)98h。經(jīng)過一系列優(yōu)化,發(fā)酵產(chǎn)物

5、濃縮凍干后的凝乳酶活性最高可達21000SU。
   另外,實驗對從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化凝乳酶粗酶的方法進行了初步探索。凝乳酶在水溶液中不穩(wěn)定極易降解,因此初提取時,在充分發(fā)酵后即以水為溶劑,使用三步固液反相接觸萃取法從固體培養(yǎng)基中萃取出發(fā)酵產(chǎn)物,經(jīng)過離心過濾后,迅速通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式濃縮粗酶液,凍干成粗酶粉。通過此方法得到粗酶粉設(shè)備簡單、便于操作且收率較高,適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
   對凝乳酶粗產(chǎn)品進行酶學性質(zhì)的

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