脂肽高產(chǎn)菌株的ARTP誘變選育、發(fā)酵優(yōu)化及鑒定.pdf

1、枯草芽孢桿菌合成的脂肽是以β-羥基脂肪酸和肽通過內酯鍵結合，以脂肪酸鏈作為疏水基團，氨基酸鏈或者環(huán)作為親水基團的一類生物表面活性劑。其表面活性強、低毒、易于降解，在生物采油、醫(yī)藥、材料、環(huán)保、食品和日化等行業(yè)具有廣闊的應用前景，已成為研究的熱點之一。本文主要從脂肽高產(chǎn)菌株的常壓室溫等離子體(ARTP)誘變選育、搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化、脂肽的性質及鑒定等方面進行了研究。
　　本研究主要內容包括：⑴對出發(fā)菌株進行搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化。通過單因素

2、實驗初步得到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖30、尿素4、酵母膏1、磷酸二氫鉀10、磷酸氫二鈉4、氯化鈉5、硫酸鎂0.3、谷氨酸鈉1.2、pH8.2。采用斜面種接種，200rpm，37℃培養(yǎng)72h，排油圈直徑由3.6提高到6.5（cm），脂肽產(chǎn)率由0.45提高到3.21（g/L）。⑵采用ARTP技術對脂肽合成菌株進行誘變選育，高產(chǎn)菌株菌落飽滿偏大，中間凸起，泡高、微發(fā)白，邊緣褶皺，菌苔存在較多的粘性物質，挑取拉絲。經(jīng)多次誘變選育，獲得一株

3、遺傳穩(wěn)定的脂肽高產(chǎn)菌株，命名為Bacillus subtilis SF90。相比初始菌株，搖瓶發(fā)酵周期縮短到60h，脂肽生物表面活性提高約2.3倍，產(chǎn)率由1.93提高到5.12（g/L）。⑶金屬元素Zn2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+單因素實驗表明：極微量的金屬離子對脂肽的合成均具有顯著促進作用；正交實驗結果表明，在培養(yǎng)基中添加ZnSO4·7H2O1.0mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.2mg/L，MnSO4·H2O0.5mg/L，表

4、面活性提高約3倍，脂肽產(chǎn)率由6.11提高到11.12（g/L）。⑷在發(fā)酵前期（0-12)h以及發(fā)酵后期（44-48）h添加0.001-0.01（g/L）的氨基糖苷類抗生素（奇霉素、慶大霉素、卡拉霉素）能夠明顯促進脂肽的合成，微量的奇霉素可造成發(fā)酵后期菌體形態(tài)拉長，利于脂肽胞外分泌降低胞內的反饋抑制，并使脂肽表面活性提高約2.2倍，產(chǎn)率由3.3提高到6.02（g/L）。⑸采用Bacillus subtilis SF90的發(fā)酵上清液，研究脂

5、肽對溫度和pH的耐受性，及其乳化性、絮凝性和抑菌性等性質。在121℃滅菌2h，脂肽生物表面活性損失率約為10％；在4℃冰箱貯存3月，生物表面活性幾乎不變；pH耐受范圍為2-12，當溶液呈弱酸及弱堿性時，生物活性則更好；相比洗潔精，脂肽發(fā)酵液對原油具有更穩(wěn)定持久的乳化效果；相比明礬與聚谷氨酸，脂肽同樣具有良好的絮凝性；對蠟樣桿菌Bacillus cereus、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa、玉米黑霉Ustilagom

6、aydis corola抑菌效果非常顯著，最低抑菌質量濃度MIC分別為0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.15mg/ml，對水稻紋枯菌、小麥全噬菌也有較好的抑制性作用。⑹用MALDI-TOF-MS技術對脂肽凍干樣品進行組份鑒定，結果表明Bacillus subtilis SF90產(chǎn)生的脂肽由Surfactin、BacillomycinD、Fengycin組成。其中，Surfactin為主要物質，出峰時間為21.5-25（min），

7、質荷比（m/z）主要包括1008.6615、1022.6710、1036.6893、1058.6682、1044.6682、1030.6370、1059.6711等；其次為Bacillomycin D，出峰時間為9.7-12（min），質荷比（m/z）為1031.5400、1045.5541、1059.5696；Fengycin的量較少，出峰時間為12.5-14.5（min），質荷比（m/z）主要包括1464.8008、1477.813