堿性蛋白酶高產(chǎn)誘變菌株的選育及發(fā)酵工藝研究.pdf

1、堿性蛋白酶是一類(lèi)最適pH在9～11的蛋白酶，屬于絲氨酸蛋白酶，它不僅能水解肽鍵，還具有水解酯鍵、酰胺鍵和轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的功能。堿性蛋白酶在洗滌劑、食品、醫(yī)療、釀造、絲綢、制革等行業(yè)都有廣泛應(yīng)用。雖然蛋白酶的研究已有多年，但目前蛋白酶制劑品還是主要被國(guó)外大公司所壟斷，盡管?chē)?guó)內(nèi)企業(yè)也有生產(chǎn)但產(chǎn)量低、價(jià)格貴等問(wèn)題導(dǎo)致企業(yè)盈利少，因此提高菌株產(chǎn)酶能力和培養(yǎng)工藝優(yōu)化仍是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　論文所用出發(fā)菌株為河南仰韶生化公司的堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株

2、，2709堿性蛋白酶菌株。首先對(duì)該菌株進(jìn)行復(fù)壯分離，得到F12菌株，酶活達(dá)到9796.8 U/mL，較原始出發(fā)菌酶活8985.6 U/mL提高9％。
　　為得到堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株，本實(shí)驗(yàn)采用低能離子束基因修飾技術(shù)來(lái)誘變選育高產(chǎn)菌株。通過(guò)對(duì)F12菌株進(jìn)行離子束注入誘變誘變參數(shù)優(yōu)化，結(jié)果顯示當(dāng)注入能量為30 KeV，注入劑量為1×1015 ions·cm-2時(shí)誘變效果較好，最后篩選得到堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株A3，其酶活為11892.8 U

3、/mL，較原始菌株酶活提高32.4%。將A3菌株進(jìn)一步做紫外誘變處理，研究表明：在紫外照射120 s、150 s時(shí)致死率分別達(dá)到81.82%、90.91%，在此誘變劑量下篩選出Z26菌株，平均酶活達(dá)到13517.7 U/mL，較A3菌株提高13.7%，比出發(fā)菌株提高50.4%，連續(xù)傳代后Z26菌株的酶活力變化在97%-103%之間，表現(xiàn)出較好的遺傳穩(wěn)定性，能夠作為工業(yè)生產(chǎn)菌株。
　　為提高產(chǎn)量降低成本，以Z26高產(chǎn)誘變菌株為實(shí)驗(yàn)菌

4、株，對(duì)影響其酶產(chǎn)量的主要發(fā)酵條件進(jìn)行單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株的最佳發(fā)酵條件：豆粕粉添加量為4%，玉米粉添加量為7%，發(fā)酵溫度為37%，發(fā)酵起始pH為7，接種量為7%，發(fā)酵時(shí)間為36 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得Z26菌株發(fā)酵后酶活力為13929.7 U/mL，比優(yōu)化前提高3%。
　　最后對(duì)高產(chǎn)菌株的堿性蛋白酶進(jìn)行初步的酶學(xué)研究。研究結(jié)果表明：該酶的最適作用溫度為37℃，最適作用pH為11，在溫度不高于50℃時(shí)